王冬冬，王晓黎，林蓓

（中国医科大学1.附属盛京医院妇产科，沈阳110004；2.附属第一医院内分泌科，沈阳110001）

吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine2，3-dioxygenase，IDO）是色氨酸沿犬尿氨酸代谢途径中第一步的限速酶，IDO过多表达可导致色氨酸缺乏和其代谢产物蓄积。前者可使细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞数量减少［1］，后者可使自然杀伤细胞杀伤功能减弱［2］，从而产生肿瘤免疫耐受。肿瘤免疫耐受和宫颈癌的发生、发展密切相关［3］。因此，研究IDO在宫颈癌免疫耐受中的作用是近期研究的新热点。本研究通过IDO基因转染宫颈癌SiHa细胞，研究IDO对裸鼠体内宫颈癌种植瘤生长的作用，以证明IDO是否可以作为宫颈癌基因治疗的潜在新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

宫颈癌细胞株SiHa培养在含10%新生牛血清、100 IU/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO2的条件下培养。

1.2 基因转染

用标准磷酸钙沉淀方法将IDO基因表达载体pcDNA3.1-IDO［4］和空白对照载体 pcDNA3.1（加拿大Invitrogen公司）转染宫颈癌SiHa细胞，经抗生素筛选后得到IDO稳定表达的SiHa/IDO细胞株和SiHa/Mock对照细胞株。

1.3 Western blot检测转染细胞IDO蛋白的表达

选择耐药克隆株，应用Western blot检测IDO和内参β-actin蛋白表达。待3种细胞（SiHa、SiHa/Mock和SiHa/IDO）细胞融合度达到95%时收集细胞，NP-40裂解液裂解后离心取上清，用蛋白测定试剂盒（新西兰BioRad公司）检测蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳后电转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，抗人IDO 抗体（TBST溶液1∶1000稀释）孵育过夜，TBST冲洗3次，二抗（TBST溶液1∶1000稀释）孵育1 h，TBST冲洗3次后曝光显影。PVDF膜经蛋白剥离液洗脱后，5%脱脂奶粉封闭，用抗β-actin抗体重复上述步骤。

1.4 细胞生长曲线的测定

应……