周 兵，张根葆，，段 婷，周 珏，吴 娟

(皖南医学院 1.病理生理学教研室;2.病理学教研室;3.蛇毒研究所，安徽 芜湖 241002)

蛇毒作为目前研究较多的一类生物毒素，其体外抗肿瘤的效果已经得到了国内外学者充分的证实，被认为对多种肿瘤细胞有着特异性的杀伤作用［1，2］。但由于蛇毒成分复杂，且副作用大，给今后开发利用这一生物资源带来了不小的困难。因此分离纯化蛇毒中具有高效低毒的有效成分，被认为是蛇毒抗肿瘤工作者研究的方向。AAVC-Ⅰ为尖吻蝮蛇毒中提取的一种活性蛋白［3］。目前已经证明其具有广泛的抗凝血作用，但其抗肿瘤活性在国内外报道不多［4］。因此，基于实验室前期对蝮蛇毒组分抗肿瘤做过的研究工作为基础，进一步探讨尖吻蝮蛇毒组分在体外抗肿瘤作用［5，6］。分离出尖吻蝮蛇毒组分-Ⅰ，观察其对小鼠肺癌LLC细胞的增殖影响并初步探讨其机制，为寻求开发高效低毒高纯度的抗肿瘤新药提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 AAVC-Ⅰ是本院蛇毒研究所利用皖南尖吻蝮蛇毒粗毒经Cellulose DE-52离子交换和Sephadex G-75分子筛两步层析后获得的酸性蛋白质，其相对分子量约为23 ku。1640-RPMI为赛默飞世生物化学制品公司产品，胎牛血清(无支原体)为杭州四季青公司产品，四唑氮蓝(MTT)试剂盒、基因组DNA抽提试剂盒、DNA-Ladder、PBS胰酶、缓冲液、双抗(青霉素-链霉素)均为浙江碧云天公司产品。

1.2 细胞系及培养 小鼠肺癌LLC细胞，为本院药理实验室馈赠。LLC细胞为贴壁生长细胞。用含10%胎牛血清、1%的双抗的1640培养液置于生长环境为5%CO2、37℃的饱和湿度的培养箱常规培养。

1.3 细胞形态的变化 取对数生长期的LLC细胞，调整为4×104个/ml，采用细胞爬片方法接种到六孔板，培养箱孵育 12 h，按照 12.5 μg/ml、50 μg/ml两个终浓度加药，对照组加等量生理盐水，在细胞培养箱内继续孵育48 h，取玻片倒置显微镜镜检。

1.4 细胞毒性检测 取对数生长期的LLC细胞，胰酶消化后，调整细胞终浓度为4×104个/ml种植于96孔板，每孔加入100 μl细胞悬液，培养箱孵育12 h。实验组每孔加入10 μl药物至终浓度为12.5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml，对照组加 10 μl生理盐水，培养箱孵育24 h。每组设6个复孔。每孔加入10 μl MTT溶液后继续孵育4 h，继续加入10 μl Formanzan 溶解液，继续培养 4 h，震荡 5 min，570 nm处测定吸光度A值。改良寇式法计算半数抑制量IC50。

1.5 细胞DNA琼脂糖凝胶电泳 按DNA抽提试剂盒操作办法，离心收集药物 0 μg/ml、12.5 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml和等量生理盐水处理 48 h 后的细胞。PBS 洗涤两遍，加入4 μl RNA 酶后，20 μl蛋白酶K混匀。加200 μl样品裂解液，70℃裂解10 min，加入200 μl混匀，PBS洗涤 2次后离心，加入60 μl洗脱液收集离心柱内DNA，80V电压下1%的琼脂糖凝胶电泳2 h，凝胶成像仪下观察DNA条带形成并拍照。

1.6 统计学处理 所得数据以SPSS 18.0统计软件包进行处理。正态或者近似正态数据用s表示，AAVC-Ⅰ比较采用Kruskal-Wallis检验，计数资料的比较采用χ2检验，P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 尖吻蝮蛇毒抑瘤组分-Ⅰ作用后细胞形态学变化 对照组LLC细胞镜下可见呈现不规则多边形、条索状贴壁生长，轮廓清楚，生长旺盛。用12.5 μg/ml、50 μg/ml药物处理后 24 h，细胞缩小、形态变圆，胞膜卷曲、褶皱、细胞聚集、死亡(图1)。

图1 AAVC-Ⅰ作用24 h后细胞形态学的变化a 对照组;b 12.5 μg/ml组;c 50 μg/ml组Fig 1 Morphological change of LLC cell treated for 24 hours by different dose of the drug

2.2 尖吻蝮蛇毒抑瘤组分-Ⅰ对LLC细胞的增殖的影响 MTT法检测结果显示，AAVC-Ⅰ能有效抑制LLC细胞的增值。其作用24 h后半数抑制浓度IC50值为43.823 μg/ml。并且随着药物浓度的加大，其抑制作用明显上升(P＜0.05)(表1)。

2.3 尖吻蝮蛇毒抑瘤组分-Ⅰ处理后细胞DNA电泳结果 在三种浓度梯度的药物作用LLC细胞48 h后，相对于对照组，药物作用组DNA片段抽提电泳均可见阶梯状DNA条带的形成(图2)。

3 讨论

肺癌是一类较为常见的恶性肿瘤，伴随着全球工业化进程的加快和环境污染程度的加大，现肺癌的发病率高居世界首位［7］。肺癌的预后极差，五年生存率仅为5% ～15%［8］。传统的手术和放化疗对于肺癌的治疗效果未取得突破性进展，因此，寻求新的生物学治疗手段已成为肺癌研究的热点，而蛇毒抗肿瘤的研究为此提供了很好的方向。

表1 AAVC-I作用LLC细胞24 h后MTT法检测结果(n=6，±s，P＜0.05)Tab 1 AAVC-Ⅰon proliferation of LLC cells after 24-hour treatment(results of MTT detection)

表1 AAVC-I作用LLC细胞24 h后MTT法检测结果(n=6，±s，P＜0.05)Tab 1 AAVC-Ⅰon proliferation of LLC cells after 24-hour treatment(results of MTT detection)

注:#表示与 AAVC-Ⅰ浓度 12.5 μg/ml组比较，P ＜0.05

AAVC-Ⅰ浓度(μg/ml)570 nm A值平均秩 抑制率(%)0.498 ±0.22 －12.5 0.400 ±0.01 31.04 25 0.320 ±0.03# 45.45 50 0.190 ±0.01# 66.92 HC 21.600 P 0 0.000

图2 AAVC-Ⅰ作用LLC细胞后DNA电泳图Fig 2 The DNA agarose gel electrophoresis of LLC cell treated with AAVC-Ⅰ

随着蛇粗毒分离、纯化技术的提高，蛇毒提取物对于肿瘤细胞的抑制和杀伤作用日益受到人们关注。国外学者Liang Zhang等人以眼镜蛇毒提取物ACTX-6对人肺癌A549细胞进行体外实验，证实对其有强效的杀伤作用［9］。Sheng-Huei Yang等人发现从眼镜蛇毒中提取的CTXⅢ，对人白血病K562细胞有明显的抑制作用［10］，张及禄等人从蝮蛇毒中分离的小分子多肽sis对宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞SMMC.7721和胃腺癌细胞SGc-7901均有杀伤作用［11］。与传统的抗癌药物相比，从蛇毒中分离出的抗肿瘤成分具有特异性强的优点，对肿瘤细胞进行杀灭、抑制的同时对正常细胞毒副作用小［12］。

本实验通过尖吻蝮蛇毒提取物AAVC-Ⅰ对小鼠肺癌LLC细胞研究，结果表明AAVC-Ⅰ能够有效地抑制LLC细胞的增殖，并呈现出剂量依从关系，其中24 h半数抑制量约为43.823 μg/ml。而在不同浓度作用细胞24 h后，显微镜下可见细胞悬浮、聚集，边界不清，胞核固缩。琼脂糖DNA电泳显示明显的DNA凋亡片段条带。均证明 AAVC-Ⅰ对LLC细胞有较强的抑制作用。其机制可能是通过损害细胞的细胞膜、干预信号转导、促进相关基因和蛋白的高表达等方式促进细胞凋亡。但具体的作用机制还需要接下来进一步深入的研究，为今后在临床上应用蛇毒提取物治疗肿瘤提供了一定的实验依据。

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