吕国庆，闫 晶，李 冠，裴大兵，何立锐，李 亮，肖 平

（北京大学深圳医院1.胃肠外科；2.手术室，广东 深圳518036）

结肠癌的常规化疗途径是将抗癌药通过静脉等血液途径注入体内，全身的不良反应较重，而且药物难以进入淋巴系统。若在术前将抗癌药物导入淋巴系统内，杀灭或减低肿瘤细胞的活性，将有助于预防复发和转移。本研究应用载药纳米碳靶向性进入淋巴系统，对小鼠结肠癌转移模型进行淋巴化疗，探讨其对肿瘤细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 小鼠结肠癌淋巴结转移模型的建立

将小鼠结肠低分化腺癌Colon 26细胞株（南方医科大学钟田雨博士提供），经细胞复苏、换液、传代等操作，制成2.5×106／ml的单细胞悬液，取雄性清洁级Balb／C小鼠（购于广东省医学实验动物中心），4－6周龄，体重18－20g，SPF（Specefic pathogen free无特定病原体级实验动物）级条件下分笼饲养。在每只小鼠左侧后肢爪垫无菌消毒后皮下接种0.04 ml（约1.0×105个）细胞悬液，接种10－12天后注射处有肿瘤开始生长，爪垫成瘤25－30天后腘窝淋巴结内有肿瘤细胞转移。

1.2 药物制备、实验分组及给药方案

药物配制：①纳米炭作为载体吸附氟尿嘧啶：1 ml纳米炭（CNP，又名卡纳林，lmlCNP含纳米炭50 mg，重庆莱美药业有限公司生产）与3ml氟尿嘧啶（5－Fu）注射液（1ml 5－FU 溶液含5－FU 25mg，上海旭东海普药业有限公司生产）混合，用振荡器振荡15分钟，制成混合液备用。②纳米炭作为载体吸附奥沙利铂：1ml纳米炭混悬液与取奥沙利铂注射液3ml（1ml注射液含奥沙利铂2mg，深圳海王药业有限公司生产）混合，用振荡器振荡15分钟，制成混合液备用。

在接种肿瘤细胞悬液的第36天，将符合实验条件的40只小鼠随机分成4组，每组10只。药物注射部位均在小鼠左后肢爪垫肿瘤生长处皮下，共注射4点，连续给药2天，每天1次。A组注射0.1ml 5%葡萄糖溶液；B组注射0.1ml纳米炭氟尿嘧啶混合液；C组注射0.1ml纳米炭奥沙利铂混合液；D组注射0.05ml纳米炭奥沙利铂混合液和0.05ml纳米炭氟尿嘧啶的混合液，每种药物各注射2点。

1.3 TUNEL法检测腘窝淋巴结转移癌细胞凋亡指数；流式细胞仪检测爪垫肿瘤细胞凋亡率

1.3.1 在注射药物结束48h后，拉颈髓法处死全部小鼠。摘取其左后肢腘窝淋巴结，经福尔马林液固定、常规制作的4μm厚度石蜡切片。TUNEL凋亡试剂盒（美国罗氏公司）检测腘窝淋巴结细胞凋亡指数，凋亡细胞呈棕褐色。每张切片选取10个高倍镜视野（400×），计数凋亡细胞占总数的百分比，细胞总数不少于1000个。计算凋亡指数（ApoptosisIndex，AI）。AI＝凋亡细胞数／细胞总数×100。

1.3.2 取爪垫肿瘤组织，用无菌手术刀片将肿瘤组织切成1cm3左右的小块，以0.25%EDTA－胰蛋白酶消化，经400目筛网滤过，制成单细胞悬液，1 000 rpm／min离心5min。沉淀细胞用孵育缓冲液重悬，Annexin V－FITC和PI避光染色，采用美国Beckman Coulter公司Elite流式细胞仪检测癌细胞的凋亡率。

1.4 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件处理实验数据，采用单因素方差分析和LSD法进行各组之间的两两比较，计量资料数据用平均数±标准差（±s）表示，P＜0.05认为有显著性差异。

2 结果

2.1 40只符合实验条件小鼠，爪垫肿瘤生长良好，第36天时种植肿瘤直径平均为10－12mm，左侧后肢腘窝区可扪及较明显肿大淋巴结。注药后各组小鼠无死亡，爪垫注药部位无溃疡及坏死。与A组相比，B组、C组、D组小鼠腘窝淋巴结黑染。

2.2 TUNEL法检测小鼠腘窝淋巴结肿瘤细胞凋亡指数结果

A、B、C及D组淋巴结肿瘤细胞凋亡指数分别为（0.915±0.263）%，（8.80±0.864）%，（8.78±0.916）%，（10.75±0.85）%，B、C和D组分别与A组相比有显著性差异（P＜0.05），D组分别与B组、C组相比差异显著（P＜0.05）。B组、C组比较无显著性差异（P＞0.05）。见表1。

表1 TUNEL法检测小鼠腘窝淋巴结转移癌细胞凋亡指数（%）

2.3 流式细胞仪检测爪垫肿瘤细胞凋亡率结果

A、B、C及D组爪垫肿瘤细胞凋亡率分别为（1.330±0.347）%，（17.360±2.894）%，（17.950±2.234）%，（24.220±3.216）%，B组、C组和D组分别与A组相比，差异显著（P＜0.05）；D组分别与B组、C组相比差异显著（P＜0.05）。C组、D组小鼠爪垫肿瘤细胞凋亡率差异不显著（P＞0.05）。见表2。

3 讨论

结肠癌最常见的转移途径是通过淋巴系统，目前针对转移淋巴结主要采用手术清扫的方法，但极易遗漏微小的转移淋巴结，可能导致肿瘤复发与转移［1］。

表2 流式细胞仪检测小鼠爪垫肿瘤细胞凋亡率（%）

正常的淋巴结基质主要由羟脯氨酸组成，表现为疏水性和无极性，淋巴结内没有动静脉，其营养主要依赖淋巴液提供，所以水溶性抗癌药物难以经由血液系统进入淋巴系统。淋巴系统具有吞噬大分子物质和微粒的特性，微粒在淋巴结的窦间隙内被摄取或被网状内皮系统主动吞噬后，一部分停留在淋巴结内，另一部分运行至下一站，到达所引流的各级淋巴结内［2］，在相应区域淋巴结长时间的滞留，这也为抗癌药物与肿瘤细胞长时间接触并被杀灭提供了可能。为了提高淋巴系统内抗癌药物浓度，目前主要是通过微粒载体将抗癌药物导入淋巴系统内，因此提出淋巴靶向化疗的观点。淋巴靶向化疗后，抗癌药物在淋巴系统内可以形成高浓度持续给药，既可有效杀伤肿瘤细胞，又可减少进入血液循环的药物剂量，减轻全身毒副作用［3］。

纳米活性炭具有超强的吸附能力和良好的淋巴靶向性［4］，对多种抗癌药物有高吸附性，其吸附机制主要靠氢键、范德华力物理吸附，抗癌药被吸附后，药物的理化性质不会发生改变。本实验所用纳米碳（卡纳琳），以平均粒径为150nm的团粒形式存在，纳米炭注射到局部组织后不能进入毛细血管［31］，而巨噬细胞对纳米炭颗粒的吞噬作用使其能够进入毛细淋巴管，并到达局部引流淋巴结。进入淋巴结的纳米炭缓慢释放抗癌药物，使其周围游离的抗癌药物始终维持一定的浓度，这种功能缓释性［5］，也是纳米炭最大特点。本研究中与A组相比，B组、C组和D组小鼠腘窝淋巴结黑染，这说明吸附抗癌药的纳米炭可以靶向性进入淋巴系统内，并长时间滞留于淋巴结内，持续发挥杀伤、杀灭肿瘤细胞的作用。

临床研究表明，氟尿嘧啶和奥沙利铂都是对结肠癌公认有效的药物，奥沙利铂联合5－FU是常用的结肠癌的一线化疗方案［6］。故本实验选用氟尿嘧啶和奥沙利铂作为淋巴化疗药物，并设计D组实验小鼠为纳米炭载氟尿嘧啶和纳米炭载氟奥沙利铂联合用药组。氟尿嘧啶、奥沙利铂也是细胞毒性抗癌药物，单药不能进行局部注射，溢出血管外可引起组织溃疡及坏死，但本实验结果显示B、C和D组的小鼠爪垫注射部位皮肤无溃疡和坏死，这可能是因为纳米炭吸附抗癌药后是缓慢释放药物，避免了因化疗药物瞬时高浓度产生局部坏死等毒副作用。

抗癌药物通过诱导肿瘤细胞凋亡是其主要治疗作用之一［7］。凋亡检测方法众多，原理各异，每种凋亡检测方法各具特点，但均有一定的局限性。流式细胞术检测早期凋亡更为灵敏，是目前较为理想的凋亡定量检测方法。腘窝淋巴结肿瘤细胞主要在边缘窦，如果分离时间不够，则细胞数量较少，如果分离时间较长，则先分离下来的细胞膜的完整性易受破坏，造成假阳性结果。因为分离到足够数量级肿瘤细胞的难度较大，所以不适宜用流式细胞仪检测其凋亡情况。原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法（TUNEL）在细胞凋亡的研究中已被广泛采用［8］，此法能快速准确地反映细胞凋亡形态特征、染色定位及其在组织中的分布，因而本实验腘窝淋巴结转移癌细胞凋亡情况选用TUNEL法检测。实验结果显示：在小鼠淋巴结转移癌细胞凋亡指数和小鼠爪垫肿瘤细胞凋亡率方面，B、C、D各组与A组相比，有显著统计学意义，D组分别与B组、C组相比，差异显著，这也证实了奥沙利铂与氟尿嘧啶联合使用具有协同抗癌作用［9］。

实验结果表明，应用载药纳米炭对小鼠结肠癌转移模型进行淋巴化疗，能够诱导种植肿瘤和淋巴结转移癌细胞的凋亡，纳米炭载氟尿嘧啶和奥沙利铂联合用药有协同增效诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

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