杨明蓉, 唐 卓, 陈应春

(1. 四川大学 华西药学院,四川 成都 610041; 2. 中国科学院 成都生物研究所,四川 成都 610041)

近年来，核酸探针杂交技术在医疗科研和临床中被广泛采用，成为一项直接检查病原体、癌基因、遗传病基因突变等的重要手段。用于杂交的核酸探针必须先进行标记，可分为同位素标记和非同位素标记两大类。生物素标记的核酸探针属于非同位素标记，它是利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理，分子杂交后用亲和素或链霉亲和素进行检测[1～4]。生物素标记探针稳定，不失活，并能配用多种检测系统，简单方便。

Richard T Pon[5]设计合成了一种较为理想的生物素标记试剂——[1-N-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)-生物素-6-氨基己基]-2-氰乙氧基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(3)。3所含的6-氨基己基侧链显著增加了生物敏感性[6]，同时3中的二甲氧三苯基增加了稳定性，不仅有利于寡核苷酸链的合成与纯化，而且还可以在DNA合成仪上通过颜色变化检测连接效率。

为了推进3的应用，本文改进文献[5]方法，先将生物素与DMTrCl(4,4′-二甲氧基三苯基氯甲烷)反应制得1-N-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)生物素(1); 1与6-氨基-1-己醇在氯甲酸乙酯中缩合制得1-N-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)生物素-6-氨基己醇(2); 2与磷试剂2-氰乙氧基-双(N,N-二异丙基)亚磷酰胺(Ⅰ)[7]反应合成了3(Scheme 1)，总收率51.0%,其结构经1H NMR,13C NMR,31P NMR和MS确证。

改进方法将文献[5]路线由5步简化为3步，提高了生物素的转化率,同时避免了昂贵的硅试剂及TBAF(四丁基氟化铵)的使用。

为了验证改进方法的可行性，本文还采用固相亚磷胺三酯法，应用3合成了一段含有十个碱基的5′-端Biotin标记的寡核苷酸链Biotin-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A(记为Biotin-A10)[8～11]，其结构经MS确证。……