布 娟 张 莹 刘 敬 庞红蕾 林淑芳 王乐今

马凡综合征(Marfan syndrome，MFS)是一种常染色体显性遗传性结缔组织病，发病率为1/5000～1/10 000，其中25%～30%的MFS患者为散发病例。MFS的典型临床表现主要涉及眼、骨骼和心血管系统。眼部的表现为晶状体脱位、高度近视伴视网膜脱离;骨骼系统的表现主要包括身材瘦长、脊柱侧凸、细长指(趾)、胸壁畸形(漏斗胸或鸡胸)、蜘蛛脚样指(趾)、韧带松弛、异常关节运动等;在心血管系统方面，主动脉根部及升主动脉进行性扩张所导致的主动脉关闭不全及夹层主动脉瘤是MFS患者最严重的并发症，二尖瓣脱垂及主动脉瓣返流也是MFS患者常见的心血管系统表现。此外，MFS的损害还可能涉及肺、皮肤、中枢神经系统等[1]。

MFS的发病原因至今尚不完全清楚，但近年来不断有研究表明FBN1、TGFBR1、TGFBR2基因的突变可导致MFS的发生。由于MFS为不完全外显性遗传疾病，患者临床表现多样化，且在不同家系之间甚至在同一家系的不同患者之间都存在着较大的表型差异。因此，本研究对收集到的一个中国人四代MFS家系进行全面的临床研究，并从已知基因附近选取微卫星标记物进行连锁分析，以确定致病基因区域及该家系致病基因是否与已知MFS基因连锁。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料 研究对象取自在北京大学第三医院眼科就诊的一个四代MFS家系，家系41名成员中共有12例患者，男7例，女5例(家系图见图1)。本研究遵循赫尔辛基宣言，在家系所有成员均知情同意的情况下，对其进行全面的检查。根据临床体征和检查结果，确定患者和正常人。根据Ghent标准进行MFS的临床诊断[2]。该标准如下:MFS特征性的眼部病变、骨骼病变、心血管病变和家族史，凡具备这四项中的任意两项者，即可确立诊断。

详细询问病史及家族史后检查视力、屈光度，使用复方托吡卡胺滴眼液进行散瞳，待瞳孔散大后使用裂隙灯显微镜和检眼镜分别检查眼前节及眼底。对家系中所有患者均进行全面的体检，包括心脏彩色超声，脊椎、胸椎正侧位X光片及神经系统MRI等检查。

Figure 1 Family figure of MFS MFS家系图

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 取外周血8～10 mL，采用美国罗氏公司的DNA分离试剂盒分步提取基因组DNA。紫外分光光度计和6 g·L－1琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA纯度和浓度后于－20℃保存备用。

1.2.2 微卫星序列的 PCR扩增 在候选基因FBN1、TGFBR1、TGFBR2相距3 cM范围内，选择具有高杂合度的微卫星标记物。引物序列由基因组数据库获取。PCR扩增体系为5.0 μL(10×GeneAmp PCR 缓冲液0.5 μL、10 mmol·L－1脱氧核糖核苷酸0.1 μL、25 mmol·L－1MgCl20.6 μL、5 ×106U·L－1GoldTMDNA 聚合酶 0.04 μL、10 mmol·L－1引物0.04 μL、30 mg·L－1基因组 DNA 1.0 μL，加水补足至5.0 μL)，PCR 反应条件:首先94 ℃ 5 min预变性，94℃变性30 s，起始退火温度59℃ 30 s，72℃延伸45 s，最后72℃延伸5 min，共35个循环。

1.2.3 基因型分析 按照PCR产物的长度，选用适当的分子内标(0.2 μL)并与高纯甲酰胺(4.0 μL)、PCR 产物(1.0 μL)混合，95 ℃加热变性3 min 后，放入冰中骤冷，以保持DNA的单链状态。毛细管电泳2.5 h。

1.2.4 数据处理 采用 Genscan 2.1软件收集数据，泳道线校正，ABI3130型遗传分析仪自动读取全部微卫星标记物的等位基因片段大小。将收集到的凝胶电泳图像转换为数字信号文件，然后进行相对分子质量内标校正和扩增片段大小分析。采用Genotyper2.1进行基因分型，采用Linkage软件包(Ver.5.1)的Mlink连锁分析软件，在常染色体显性遗传两等位基因系统模式下，设定杂合子中致病基因的频率和外显率分别为0.000 1和0.999 9，设定各等位片段在群体中具有相同频率，分别在重组率(θ)为0.00、0.10、0.20、0.30、0.40 及 0.50 时计算 LOD值。结果判断标准:LOD值＞1为提示连锁;LOD值＜－2为否定连锁。

2 结果

2.1 临床检查结果 家系中所有患者均具有MFS的眼部表现及骨骼系统表现(见表1)，仅有2例患者具有心血管系统损害。在询问病史及家族史时，家属自诉患者Ⅱ∶3、Ⅲ∶11均是由于心脏病(具体诊断不详)导致死亡。

2.2 遗传学连锁分析结果 该家系的遗传方式为常染色体显性遗传，患病的个体为杂合子。3号染色体微卫星标记物D3S1609和D3S2432与该家系连锁，其 LOD值均为正值，D3S2432最大 LOD值为3.22(见表2)，LOD值≥3确定连锁。

表1 MFS家系患者的临床检查结果Table 1 Clinical examination results of MFS family

表2 微卫星位点基因的连锁分析的LOD值Table 2 Linkage analysis LOD scores of microsatellite markers

3 讨论

MFS的诊断主要依据患者的临床体征，这些体征主要涉及心血管系统、眼睛系统及骨骼系统。现在的诊断标准是1996年重新修正后的标准:即具有典型的家族史、心血管系统、眼睛系统及骨骼系统的主要诊断体征，以上4项中具备2项就可确诊。心血管系统的主要诊断体征为:升主动脉扩张伴或不伴主动脉瓣返流，以及Valsava窦扩张，升主动脉夹层。眼睛系统的主要诊断体征是晶状体脱位。骨骼系统的主要诊断体征是:鸡胸;漏斗胸;上肢伸展长度/身高的比值大于1.05;腕征、指征阳性;脊柱侧弯大于20°，或脊柱前移;肘关节外展减小(＜170°);足踝中部关节脱位形成平足;任何程度的髋臼前凸(髂关节内陷)。

本研究收集到的四代家系，经详细的临床检查，确诊为MFS。并且其遗传规律符合常染色体显性遗传。近来越来越多的研究表明FBN1、TGFBR1、TGFBR2基因的突变与MFS的发生存在着紧密的联系[3-7]。对于MFS的遗传家系来说，约90%MFS家系是由FBN1基因突变引起的。突变后的基因产生异常的FBN-1，通过对正常FBN-1产生显性负效应，干扰原纤维蛋白的聚合及微纤维的聚集。突变后的FBN1还有可能通过破坏弹性纤维的稳定性或本身对蛋白水解酶敏感性的改变等机制导致全身结缔组织的改变[8]。

由于在某些MFS的患者体内检测到了TGFBR1基因和TGFBR2基因的突变，所以提出了MFS的发生可能与异常的转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)信号有关。TGF-β 是一种分泌多肽，参与细胞外基质形成和内环境稳定，在细胞增殖、分化、凋亡和细胞外基质中发挥重要作用。TGF-β与I型和Ⅱ型受体结合成复合物，在相应配体作用下，通过磷酸化过程，激活跨膜受体，活化的跨膜受体与下游的信号分子相作用从而传递活化信号[9]。

当TGFBR1和 TGFBR2突变后，影响了 TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体的功能，从而干扰了TGF-β信号转导的整个过程。此外，近年来研究显示:在细胞外基质中，FBN1与TGF-β信号有功能上的相关性。因此，MFS的病理机制可能与 TGF-β信号异常有关[10]。

FBN1 基因定位于15q15-q21.1，长230 kb，有65个外显子，编码2871个氨基酸的蛋白质。TGFBR1基因位于9q22，长49 kb，有9个外显子，编码503个氨基酸的蛋白质。TGFBR2基因位于3p22，长87kb，有7个外显子，编码567个氨基酸的蛋白质。其中报道最多的是FBN1基因的突变，该基因最大，外显子数目最多，其突变可以发生在整个基因的任意区域，没有集中的突变热点，这就导致了筛查该基因突变的难度增加。目前国内外针对MFS的研究主要是检测FBN1基因是否存在突变，而基因突变检出率较低也是目前研究此疾病的最大难题。因此，本研究通过对MFS家系进行已知基因的连锁分析，以期达到确定该家系致病基因位置的目的，从而不需耗费过多的人力、财力对基因盲目的进行直接测序。

连锁分析是通过寻找与某一遗传性状共同传递的遗传性标记物来确定某种疾病的致病基因在基因组中的位置。计算最大优势对数LOD值(即两个位点确实连锁的可能性与两个位点不连锁的可能性的比值的常用对数值)，LOD正值代表支持连锁，≥+3代表确定连锁，负值代表不支持连锁，≤－2代表排除连锁。本研究中的MFS家系，其致病基因与位于TGFBR2基因附近的微卫星连锁，因此可以推断MFS的已知致病基因TGFBR2可能是该家系的致病基因。TGFBR2是在2004年新发现的与MFS的发病有关的基因[11]。至今已发现的TGFBR2基因突变有7个，其突变均发生在TGFBR2激酶结构域的保守氨基酸(丝氨酸、苏氨酸)序列，突变导致TGF-β信号转导功能失调。今后的研究工作将对家系患者进行TGFBR2基因的直接测序，以期发现有意义的突变，为进一步阐述MFS的分子发病机制及进行家系产前诊断提供理论依据。

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11 Mizuguchi T，Collod-Beroud G，Akiyama T，Abifadel M，Harada N，Morisaki T，et al.Heterozygous TGFBR2 mutations in Marfan syndrome[J].Nat Genet，2004，36(8):855-860.