孙丽娟 胡 丹 潘 峰 马吉献 苏静波

青光眼、年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性、视神经外伤等人类主要致盲性眼病，均是以视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells，RGC)及其纤维的渐进性死亡为主要特点[1-2]。由于其损伤后不可再生，此类疾病目前尚无有效的治疗方法。缺血缺氧是视网膜疾病的共同病理特点之一[3]。视网膜Müller细胞是视网膜内最主要的胶质细胞，依靠其细胞内高亲和力 L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(glutamate-aspartate transporters，GLAST)维持 RGC细胞外谷氨酸(glutamate，Glu)浓度，保护RGC免受Glu兴奋性毒作用[4-5]。未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction，UPR)是细胞在感染、炎症、细胞因子、外伤等刺激下，初期表现为内质网内大量非折叠蛋白蓄积，进而触发的一系列反应[6]。在中枢神经退行性疾病、糖尿病、癌症等疾病中均已被证实。近来研究表明，UPR也可能是RGC及其纤维渐进性死亡的首发病理机制[7]。本实验组前期研究证实:视神经钳夹伤后，存在UPR的节细胞周围必然存在强表达GLAST的视网膜 Müller细胞突起包绕[8]。因此，研究GLAST与UPR相关因子X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)、C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)之间的关系对RGC的保护有重要的意义。

本实验应用化学缺氧诱导剂氯化钴(CoCl2)刺激原代培养大鼠视网膜Müller细胞，观察缺氧后不同时间点视网膜 Müller细胞是否存在 UPR，以及GLAST与UPR相关因子XBP1、CHOP的表达情况。探讨UPR与GLAST表达和数量变化的关系，为研究视神经保护提供新的证据。

1 材料与方法

1.1 材料 超净操作台(苏州净化设备有限公司)、细胞培养箱(德国，Thermo公司)、荧光倒置显微镜(日本，Olympus公司)、流式细胞仪(美国，Beckman公司)、胎牛血清(FBS;美国，Gibco公司)、CoCl2(美国，Sigma公司)、DTT(美国，Sigma公司)、XBP1、CHOP、GLAST上下游引物(大连宝生物工程有限公司)、兔抗大鼠GLAST、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)抗体(美国，Abcam 公司 )、异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗兔IgG、罗丹明(TRITC)标记山羊抗兔IgG、山羊血清封闭液(北京中杉金桥生物技术有限公司)、Trizol总RNA提取液(美国，Invitrogen公司)，RT-PCR逆转录试剂盒(日本，Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 视网膜Müller细胞原代培养 参考国内外研究者方法[9-11]，取出生后3～7 d SD大鼠10只，剥离视网膜神经上皮层。将收集的视网膜剪成约1 mm×1 mm的碎片，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶2 mL，37℃消化20 min。加入含体积分数20%FBS的DMEM培养基终止消化，充分吹打，悬液经筛网(200目)过滤，收集滤液，1000 r·min-1离心 5 min，弃上清，加入2 mL含体积分数20%FBS的DMEM培养基，吹打成单细胞悬液。将细胞悬液接种于培养瓶中，补充含体积分数20%FBS的DMEM培养基至3 mL，放入含体积分数5%CO2的细胞培养箱(37℃)中培养。静置3 d后换液，换液时用吸管轻轻吹打瓶壁，将贴壁不紧的细胞吹打下来;7～10 d后融合，吸弃原瓶培养基，PBS液洗涤3次，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶，相差显微镜下见细胞收缩、部分细胞悬浮后停止消化。加入含体积分数20%FBS的DMEM培养基继续培养，如此2～3次，细胞形态基本一致后按1∶2比例传代，传代后的细胞改用含体积分数10%FBS的DMEM培养基培养进行鉴定和下一步实验。

1.2.2 细胞鉴定

1.2.2.1 细胞免疫荧光染色 GS参与谷氨酸循环，是视网膜 Müller细胞中特异的生物酶[12-13]，可作为特异性标志物鉴定Müller细胞。将100×103个细胞接种于预置盖玻片的24孔培养板中行细胞免疫荧光染色:40 g·L-1多聚甲醛固定细胞爬片，室温30 min;3 g·L-1Triton-X100通透化，室温孵育30 min;体积分数10%正常山羊血清封闭液，37℃孵育30 min;一抗为兔抗大鼠GS抗体(1∶1000)，4℃过夜;二抗为罗丹明(TRITC)标记山羊抗兔IgG(1∶100)，37 ℃ 孵育 1 h;4’，6-二脒基-2-2 苯基吲哚(DAPI)衬染胞核10 min;体积分数50%甘油封片。荧光倒置显微镜下观察，照相。

视网膜 Müller细胞上最主要的谷氨酸转运体——GLAST是位于细胞膜上的糖蛋白[13]。本实验将其作为特异性标志物鉴定Müller细胞。操作步骤同细胞免疫荧光GS染色。一抗为兔抗大鼠GLAST抗体(1∶1000)，4℃过夜;二抗为FITC标记山羊抗兔IgG(1∶100)，37℃孵育1 h。

1.2.2.2 流式细胞仪检测 取第3代视网膜Müller细胞，PBS洗涤细胞2遍，调整细胞浓度至4×109L-1，取细胞悬液10 μL，一抗为兔抗大鼠 GLAST抗体(1∶100)，37℃孵育30 min，二抗为FITC标记山羊抗兔IgG(1∶100)，室温30 min，离心洗涤2遍，使用流式细胞仪检测视网膜Müller细胞上GLAST表达阳性率。

1.2.3 实验分组 取来源于同一原代细胞的第3代细胞消化接种(约300×106L-1)于6孔培养板中，待各孔细胞基本铺满板底随机分为3组:第1组为 CoCl2缺氧[13]干预组(200 μmol·L-1)，干预时间分别为:0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，每时间点3孔;第2组为阳性对照二硫苏糖醇[14](DTT)干预组(2 mmol·L-1)，干预时间分别为:0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，每时间点 3 孔;空白对照组 3 孔，仍按含体积分数20%FBS的DMEM进行常规培养。

1.2.4 实时荧光定量 PCR检测 XBP1、CHOP和GLAST的mRNA表达 (1)总RNA提取:Trizol法提取视网膜Müller细胞总RNA，紫外分光光度计检测其纯度和浓度，8 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。采用合格的RNA标本，按试剂盒方法逆转录合成cDNA，应用紫外分光光度计测定其浓度，-20℃保存。(2)引物设计:应用GeneBank基因库中大鼠XBP1、CHOP、GLAST的mRNA基因序列，由大连宝生物有限公司设计并合成引物。XBP1引物:上游:5’-GATGAATGCCCTGGTTAC-3’，下游:5’-ATGTTCTGGGGAGGTGAC-3’，大小 150 bp;CHOP 引物:上游 5’-CACAAGCACCTCCCAAAG-3’，下游 5’-TCATTCTCCTGCTCCTTCT-3’，大小 165 bp;GLAST引物:上游 5’-ATGCTGAGTGAAGACTGCAAGGA-3’，下游 5’-GGATGGTTGCCCTCAGAGATG-3’，大小98 bp;β-actin:上游 5’-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下 游 5’-TTCTCCAGGGAGGAAGAGGAT-3’，大小100 bp。(3)反应体系和反应条件:所有cDNA工作液按如下PCR反应体系分别配制:核酸凝胶染液 12.5 μL，cDNA 1800 ng，上、下游引物各0.75 μL，加入 ddH2O 定容至 25 μL。RT-PCR 反应条件:95℃预变性10 min，95℃ 5 s，60℃退火和延伸30 s，进行40个循环。在每个循环的延伸末期检测荧光信号。反应结束后电脑自动绘制各目标基因的扩增曲线和溶解曲线，并显示阈值循环数(threshold cycles，CT)。以β-actin基因的表达量作为内参，校正目标基因的表达量，计算公式为:目标基因相对表达量 =2-△CT，△CT=CT目标基因-CTβ-actin。

1.3 统计学分析 采用SPSS 13.0软件行单因素方差分析(AVONA)及LSD检验对实时荧光定量PCR结果进行统计学分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 视网膜Müller细胞原代培养及细胞免疫荧光染色结果 原代细胞培养8～10 d细胞融合成单层，细胞多呈星形、梭形、多角形等形态，胞浆丰富，核膜清晰，胞核呈椭圆形位于细胞中央，呈镶嵌样排列(图1)。细胞免疫荧光GLAST染色:细胞膜及突起发出绿色荧光，细胞核未着色(图2)。细胞免疫荧光GS染色:细胞质内出现红色丝状及颗粒状物质，细胞核衬染为蓝色(图3)。显微镜下随机连续观察5个高倍视野，每处视野计数100个细胞，统计阳性细胞率发现，90%以上细胞GLAST/GS抗体染色阳性。

Figure 1 Image of primary retinal Müller cells under light microscope 光镜下原代视网膜Müller细胞

Figure 2 Positive staining of GLAST antibody in retinal Müller cells 视网膜Müller细胞GLAST抗体荧光染色阳性

Figure 3 Positive staining of GS antibody in retinal Müller cells视网膜Müller细胞GS抗体染色阳性

2.2 流式细胞仪检测结果 目前Müller细胞的鉴定主要依据其细胞形态特征及免疫组织化学的指标进行，本实验利用流式细胞检测技术检测GLAST在Müller细胞上的表达情况(图4)。结果提示:GLAST表达阳性率为(84.66 ±3.51)%。

2.3 实时荧光定量 PCR检测 XBP1、CHOP和GLAST的mRNA表达 CoCl2干预在一定时间内诱导大鼠视网膜 Müller细胞上的 XBP1、CHOP、GLAST的mRNA表达上调。在干预后3～24 h，随着干预时间延长，三者的表达量也逐渐增加。当干预时间达24 h时，三种因子的mRNA表达水平均达到峰值。之后表达呈下降趋势(P＜0.05，见表1)。

Figure 4 GLAST expressions in retinal Müller cell identified by flow cytometry 流式细胞仪检测视网膜Müller细胞中GLAST表达

DTT干预组:刺激后3～24 h，随干预时间延长，XBP1、CHOP、GLAST的 mRNA表达上调且逐渐增加。当干预时间达24 h时，三种因子的mRNA表达水平均达到峰值，之后表达呈下降趋势;72 h检测表达量，发现仍呈下降趋势(P＜0.05，见表2)。

表1 实时荧光定量PCR检测缺氧条件下XBP1、CHOP、GLAST的mRNA表达变化Table 1 Expression of XBP1，CHOP and GLAST mRNA detected by RT-PCR under hypoxia(±s，n=7)

表1 实时荧光定量PCR检测缺氧条件下XBP1、CHOP、GLAST的mRNA表达变化Table 1 Expression of XBP1，CHOP and GLAST mRNA detected by RT-PCR under hypoxia(±s，n=7)

Note:Compared with control，#P ＜0.05，*P ＜0.01

Group Control 3 hours 6 hours 12 hours 24 hours 48 hours 72 hours XBP1 1.00 ±0.12 1.24 ±0.20# 1.46 ±0.19* 2.76 ±0.31* 3.31 ±0.40* 2.49 ±0.30#1.57 ±0.22 CHOP 0.98 ±0.10 1.14 ±0.19 1.34 ±0.22* 2.26 ±0.32* 3.80 ±0.52* 2.55 ±0.35 1.77 ±0.28 GLAST 1.00 ±0.11 1.12 ±0.13 1.29 ±0.16* 1.82 ±0.25* 2.41 ±0.32*2.02 ±0.29 1.36 ±0.14

表2 实时荧光定量PCR检测DTT刺激后XBP1、CHOP、GLAST的mRNA表达变化Table 2 Expression of XBP1，CHOP and GLAST mRNA detected by RT-PCR after DTT stimulation(±s，n=7)

表2 实时荧光定量PCR检测DTT刺激后XBP1、CHOP、GLAST的mRNA表达变化Table 2 Expression of XBP1，CHOP and GLAST mRNA detected by RT-PCR after DTT stimulation(±s，n=7)

Note:Compared with control，#P ＜0.05，*P ＜0.01

Group Control 3 hours 6 hours 12 hours 24 hours 48 hours 72 hours XBP1 0.95 ±0.10 1.14 ±0.13# 1.33 ±0.17* 2.45 ±0.30* 3.14 ±0.32* 2.35 ±0.27#1.68 ±0.23 CHOP 1.01 ±0.10 1.25 ±0.19 1.34 ±0.21* 2.06 ±0.29* 2.52 ±0.36* 2.11 ±0.28# 1.47 ±0.26 GLAST 0.99 ±0.20 1.05 ±0.19# 1.43 ±0.23* 1.77 ±0.26* 2.26 ±0.28* 1.84 ±0.27*1.56 ±0.22

3 讨论

Müller细胞是脊椎动物视网膜中最主要的胶质细胞，其胞体位于内核层，放射状突起贯穿视网膜全层呈蜂窝状，包绕RGC胞体。Müller细胞的主要功能包括:对RGC的营养支撑、储存合成糖原、参与血-视网膜屏障、表达电压门控离子通道和神经递质受体等，其在维持细胞内环境稳态中起重要作用。研究认为细胞外谷氨酸浓度升高对RGC有潜在毒性[15]。Müller细胞调节细胞外谷氨酸浓度的关键步骤是通过高亲和力的GLAST将这种氨基酸逆着细胞内外浓度差从细胞外转运至细胞内，以维持RGC细胞外正常谷氨酸浓度，达到对RGC的保护作用。Müller细胞能在30 min内将谷氨酸的浓度降至无毒水平，此作用主要与其细胞膜上谷氨酸转运体的功能和数量有关[15]。有研究人员利用反义寡核苷酸技术阻断GLAST，发现大鼠视网膜玻璃体内的谷氨酸浓度和死亡的 RGC都明显增加[16]。这说明GLAST对视网膜损伤后谷氨酸的清除发挥着重要的作用。研究发现，大鼠PC12细胞缺氧24 h后，谷氨酸转运体EAAC1、GLT-1以及GS表达上调，并且细胞外谷氨酸的摄取量增加[17]。而长时间缺氧会使大脑星形胶质细胞谷氨酸转运体GLAST、EAAT2表达降低，导致细胞外谷氨酸的摄取量减少，缺氧诱导大鼠视网膜Müller细胞在短时间内GS、GLAST表达升高[19]。但GLAST在受到外界刺激时变化的原因尚未确切。

UPR是细胞早期对抗内质网应激(ERS)产生的自我保护机制。主要是通过三种信号转导蛋白PERK、IRE-1、ATF6有序活化和整合，降解未折叠蛋白。但当刺激持续存在，就会启动凋亡程序，由促生存转变为促凋亡[20]。XBP1是需肌醇酶1(inositol requiring enzyme 1，IRE-1)通路中的重要分子。具有高度转录活性的XBP1不仅可诱导ER相关伴侣分子GRP78表达上调，且可增加ER相关未折叠蛋白的降解。CHOP是ERS特异性转录因子，PERK通路激活后，随着UPR时间延长，通过诱导CHOP表达升高，进而诱导p53表达而启动凋亡程序。因此它是UPR从抗凋亡向促凋亡转变的重要信号分子之一。有文献报道脊髓损伤后，脊髓内三种细胞中神经元和少突胶质细胞发生UPR后都会迅速启动凋亡程序，而星状胶质细胞不启动或难启动凋亡程序[21]。提示星状胶质细胞内UPR的保护机制具有实际应用意义。目前对离体缺氧刺激视网膜Müller细胞是否发生UPR鲜有报道。

本研究结果显示，给予视网膜Müller细胞缺氧刺激，实时荧光定量PCR结果显示，GLAST与UPR相关因子XBP1、CHOP表达均呈先升高后降低趋势，在缺氧后24 h表达最高，之后下降。DTT干预组GLAST与UPR相关因子XBP1、CHOP表达趋势与缺氧组一致。本实验还证实:体外缺氧刺激后视网膜Müller细胞存在 UPR;GLAST与 UPR相关因子XBP1、CHOP的表达趋势一致。由此推测，缺氧刺激后，视网膜Müller细胞的UPR与GLAST变化有相关性，可能是GLAST表达变化的启动因素之一。其原因可能是UPR早期的保护功能使GLAST升高，随着缺氧时间的延长，UPR凋亡程序启动使视网膜Müller细胞功能减退，GLAST也相应减少。但两者间因果关系及确切机制尚需进一步探索。

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