潘宏升，荀凤娇，田素飞，年 华，褚云卓＊

（1.中国医科大学附属第一医院 检验科，辽宁 沈阳110001；2.辽宁省第三人民医院 检验科）

目前，全球范围内由社区相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（CA－MRSA）引起的感染呈逐年上升趋势，CA－MRSA与医院相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（HA－MRSA）存在许多不同，CA－MRSA多感染无相关危险因素的健康人群，且发病年龄较轻［1］；其常携带多种与致病力相关的外毒素，其中杀白细胞（PVL）毒素被证实能够引起坏死性筋膜炎、败血症、中毒休克综合征等多种进行性、坏死性疾病［2］，严重者甚至死亡。因此，有必要对CA－MRSA进行毒力检测及同源性分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2007年1月至2008年9月门诊及住院患者连续分离、不重复非痰标本CAMRSA菌株5例，其中浓汁3份，血液2份。

1.1.2 主要试剂及仪器 细菌基因组提取试剂盒，博日生物技术有限公司；Taq酶及PCR相关试剂，宝泰克大连生物科技有限公司；PCR引物，上海生工有限公司合成；脉冲场凝胶电泳试剂，美国Bio－Rad生物科技有限公司；PCR9700（Gene Amp）；脉冲场凝胶电泳仪（美国Bio－Rad），HZQ－F160振荡培养箱（上海）；超速低温离心机（贝克曼）；紫外凝胶成像仪（美国Alpha Innotech）。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板提取 采用细菌基因组提取试剂盒，按照说明提取基因组DNA。

1.2.2 PVL基因检测 引物设计及参数参照文献［3］，上 游 引 物：5’－ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGATCCA－3’，下 游：5’－GCAT－CAACTGTATTGGATAGCAAAAGC－3’。

1.2.3 基因序列分析 目的基因经PCR扩增阳性，片段大小与预计值相符，产物经上海生工有限公司纯化、测序，在GenBank比对确证。

1.2.4 脉冲场凝胶电泳分析 新鲜菌株包埋于1%低熔点琼脂中，溶葡球菌素及溶菌酶进行破壁（37℃，2h），蛋白激酶 K原位消化（50℃，48h），经限制性内切酶SmaI酶切（25℃、140r／min，4h）；……