黄天明，赵飞兰，莫发荣，晁耐霞，谢小薰，罗国容

（广西医科大学 组 织学与胚胎学教研室，广西 南 宁530021）

本课题组应用SEREX（serological analysis of recombinant cDNA expression libraries）技术，从广西人肝细胞癌（HCC）的cDNA文库中筛选出一系列 HCC相关的抗原基因［1，2］，其中编号为 HCC－27－9－3的基因序列与kinectin的N末端同源，且初步检测表明，其抗体在HCC病人中有较高的特异性和阳性率［3］。本研究在对此kinectin基因进行了体外重组、克隆及表达的基础上［4］对其诱导及纯化条件进行了优化，并检测了所得MBP－kinectin融合蛋白致敏DC及刺激自体T淋巴细胞增殖的能力，为其开发应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 HCC－27－9－3重组噬菌粒为本室自存；大肠杆菌DH5α和 TB1，质粒p MAL－C2，Amylose resin亲和层析柱，RPMI1640培养液，胎牛血清（FCS），Ficoll分离液（1.077 g／ml），T细胞尼龙毛柱，脂多糖（LPS），重组人rhGM－CSF、rhIL－4、IL－12、IFN－γ，ELISA检测试剂盒，MTT，IPTG，X－gal，Taq酶，d NTP，Bam HI，HindIII，XmnI，T4DNA 连接酶，DNA marker，PEG8000，小分子量胶回收试剂盒，其余化学试剂均为国产分析纯；SDS－PAGE由3%浓缩胶和12%分离胶组成，蛋白定量分析用BIO－RAD公司的Quantity One凝胶分析软件，引物均由上海生工合成，蛋白的飞行质谱测序分析送复旦大学进行。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒的构建及鉴定 用PCR扩增HCC－27－9－3重组噬菌粒中的kinectin目的基因片断并将其插入p MAL－C2载体质粒中，先转入DH5α菌，经蓝白斑实验、PCR法、酶切法及DNA测序筛选出正确的重组子后，再转入TB1表达宿主菌。

1.2.2 目的基因在宿主菌中的诱导表达 将转有正确重组质粒的TB1工程菌置于LB－Amp＋板中培养过夜后，挑单克隆至3 ml LB－Amp＋培养液中，37℃恒温振荡培养至OD600为0.4，取1 ml留作诱导前对照，余加入IPTG至终浓度0.5 mmol／L，继续诱导3个小时，8 000 r／min离心10 min，弃上清，收集菌体，每克菌体沉淀加入15 ml过柱缓冲液，置冰浴中，超声波破菌3个周期（每个周期20次，每次3 s，间歇4 s），4℃12 000 r／min离心30 min，分别收集上清液及沉淀，SDS－PAGE电泳鉴定。……