徐 斌，石 英，惠 威，何佳丽，魏琳琳，王 征，陈德喜

（首都医科大学附属北京佑安医院 肝病内分泌科，北京100069）

获得性免疫缺陷综合征（Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS）简称艾滋病，是由 HIV（Human Immunodeficiency Virus）病毒引起的一种传染性疾病。HIV病毒侵入人体后破坏机体的免疫系统，引起一系列严重疾病，病后无特效疗法，病死率高。人类第17号染色体的16个基因组由两对亲缘关系很近的基因组构成，即CCL3L—CCL3L1和CCL4—CCL4L1。CCL3和CCL3L1蛋白93个氨基酸中有88个相同，这两个蛋白均是CCR5受体的配体，在体外试验中均可抑制 HIV－1病毒复制［1］。影响HIV－1易感性的宿主因素很多，人们由早期对HLAⅠ等位基因、CCR5和CCR2基因变异的关注，转向CCR5结合细胞因子水平的不同。本研究探讨CCL3L1基因拷贝数不同对HIV－1易感性的影响，有助于监测个体对HIV－1的易感性，对监测疫苗的有效性具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 健康人群 2005年5月至2006年10月间，北京佑安医院血库，采集97例健康献血原的抗凝全血。其中男66例，女31例，平均年龄36±18岁。

1.2 HIV／AIDS患者 2005年5月至2006年10月间，北京佑安医院门诊或住院的HIV／AIDS患者81例，男性54例，女性27例，平均年龄37±1.2岁。所有患者均为血液传播感染并未经高效抗逆转录病毒治疗，病程平均6.2±0.3年。

1.3 实验方法

1.3.1 基因组DNA提取 按QIAamp DNA Mini Kit基因组提取试剂盒说明书步骤进行。

1.3.2 实时定量PCR检测CCL3L1基因拷贝数引物选择：（1）CCL3L1引物：sense primer：5’－tctccacagcttcctaaccaaga 3’；antisense primer：5’－ctggacccactcctcactgg 3’。（2）管家基因β－globin引物：sense primer：5’－ggcaaccctaaggtgaaggc 3’；antisense：5－ggtgagccaggccatcacta 3’。

以上引物由宝生物公司合成。SYBR反应体系：5×SYBR Green 25μl，引物（25μmol／L）2.5 μl，dNTP（10mmol／L）4.0μl，Mg2＋4.0μl，cDNA1.0μl，Taq酶0.25μl，H2O 5μl，10×buffer 5.0μl。反应条件：92℃2min预变性，92℃30s变性，55℃30s退火，72℃30s延伸，35个循环，72℃7min。反应结束后，由电脑自动分析并计算结果。

1.3.3 HIV／AIDS患者血浆中 HIV RNA水平的定量检测 采用bDNA法进行检测。使用德国Bayer公司的System 340bDNA分析仪，试剂采用厂家配套试剂。

1.3.4 HIV／AIDS患者流式细胞仪检测 CD4＋T细胞数量 采用BD公司FACS Calibur Flow Cytometry System，试剂采用BD公司试剂TriTEST CD4／CD8／CD3with TruCOUNT tubes，检测分析软件使用MultiSET自动软件。

1.4 统计学分析

采用SPSS14.0统计软件，以是否患HIV－1感染作为因变量，以CCL3L1基因拷贝数作为自变量经logistic回归分析评估其与HIV－1易感性的关系。采用Speraman相关分析和cubic回归分析，评估HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷贝数与病毒载量的相关性。采用直线回归分析HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷贝数和CD4＋T细胞计数。检验水准取α＝0.05，P＜0.05有显著性差异。

2 结果

2.1 中国汉族健康人群和 HIV／AIDS患者CCL3L1拷贝数分布

中国汉族健康人群的CCL3L1基因拷贝数呈poisson分布，中位数为0.943329。百份位数25%和75%分别为0.395930和1.986504。见图1。

图1 汉族健康人群和HIV／AIDS患者CCL3L1拷贝数分布

2.2 CCL3L1基因拷贝数对HIV易感性的影响

以健康中国汉族人群CCL3L1基因拷贝数的中位数1为截断值，应用Logist回归分析。结果表明：－2对数似然值为221.965，Cox和Snell的R2为0123，Nagellerke的R2为0.164，Hosmer和 Lemeshow的拟合优度检验统计量Chi－square为10.563，df为8，p为0.228；Wald统计量：P 值为0.001＜0.05，OR为0.501，95%可信区间（0.33～0.761），自变量CCL3L1基因拷贝数入选，方程分类能力达57.90%。Logistic回归的分类概率方程为：

根据该方程，中国汉族健康人群CCL3L1平均基因拷贝数为1，若个体CCL3L1基因拷贝数（X）高于汉族健康人群平均基因拷贝数，这意味着该人不易发生HIV－1感染，低于汉族健康人群平均拷贝数者有较高的易感性。

2.3 HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷贝数与病毒载量的相关性

应用Spearman相关分析，HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷贝数与病毒载量呈负相关性（correlation coefficient＝－0.804，P＝0.000）。

应用曲线回归分析：将病毒载量取Log值后，做曲线评估，应用cubic三次函数曲线模型R2＝0.639，P 值＝0.000，回归方程：LogHIV RNA＝5.656－1.397 X－0.988 X2＋0.585 X3（X 代 表CCL3L1基因拷贝数）。见图2、3。

2.4 HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷贝数与CD4＋T细胞计数的相关性

应用Spearman相关分析，HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷贝数与CD4T细胞计数密切正相关（correlation coefficient＝－0.893，P＝0.000）。

应用直线回归分析得到回归方程：CD4＋T细胞数＝140.805＋423.063×CCL3L1拷贝数，R值0.869，P值0.000，得到相同结论。见图4。

图2 CCL3L1基因拷贝数和LogVL Cubic曲线图

图3 HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷贝数与病毒载量分布

图4 HIV／AIDS人群CCL3L1基因拷贝数与CD4T细胞计数分布

3 讨论

CCL3L1又称LD78β，是CD4＋T细胞的趋化因子，一种93氨基酸的小蛋白，是趋化因子受体CCR5的天然配体之一，CCR5是HIV－1R5株进入CD4＋T细胞的主要辅助受体［2］。

β－趋化因子受体CCR5可以在多种免疫细胞表面表达，包括T淋巴细胞和巨噬细胞，主要表达于记忆性T细胞。既往研究表明CCR5基因变异影响HIV－1的易感性，32碱基的缺失（△－32）如为纯合子则对HIV－1不易感，如为杂合子则宿主的病毒载量很低而且疾病进展缓慢［3］。Townson等报道CCL3L1基因拷贝数高的个体，CCL3L1蛋白产物会更多，并推断CCL3L1基因拷贝数目不同会影响HIV－1的易感性和疾病的进展［4］。Gonzalez及其同事在1999年研究也发现CCR5配体的水平不同也影响HIV－1的易感性和疾病进程，从此人们开始关注CCR5的配体研究，这些配体绝大部分都是细胞因子［5，6］。高拷贝量CCL3L1可以抑制 HIV感染和疾病进程的直接原因：游离细胞因子可引发炎症反应，同时在空间结构上抑制HIVgp120与CCR5结合。CCL3L1可以影响CCR5的表达，随着CCL3L1基因拷贝数的增加，CCL3LI蛋白激活粒细胞数目也会增加［7］。CCL3L1拷贝数与T细胞表达CCR5的量成反比关系，体外试验表明，高拷贝CCL3L1作为CCR5调节信号，引起CCR5受体分子内陷，造成HIV－1的gp120蛋白不能与CCR5结合，从而不能进入宿主细胞［8］。

Bugeja等研究268名澳大利亚HIV－1感染者和260名未感染者，以发现他们所含有的细胞因子CCL3L1基因水平。研究结果表明，HIV－1未感染者中CCL3L1阴性率2.3%，CCL3L1水平的高低与 HIV－1 易 感 性 以 及 疾 病 进 程 无 相 关 性［9］。Gonzales等调查来自57个民族的1064名健康人的CCL3L1复制水平，同时检测4308名HIV－1阳性非洲裔美国人、欧洲人、西班牙裔美国人中CCL3L1基因水平，以发现不同种族人群CCL3L1基因数目不同是否影响HIV－1易感性和疾病进程。低于同种族CCL3L1平均基因拷贝数者，对 HIV－1更易感，感染风险率达39%，感染后疾病进展到艾滋病期发生率增长26%。高于同种族CCL3L1平均基因拷贝数者，对HIV－1不易感，降低风险率4.5%－10.5%［10］。 本 研 究 发 现 中 国 汉 族 健 康 人 群 的CCL3L1基因拷贝数中位数为1，与欧美种族和非洲裔种族的CCL3L1不同，比他们的CCL3L1平均基因拷贝数都低。本研究检测中国汉族健康人群97例和HIV／AIDS人群81例CCL3L1基因拷贝数，发现低于同种族CCL3L1平均基因拷贝数者，对HIV－1更易感，感染风险率达34.3%。初步探讨CCL3L1基因拷贝数和病毒载量及CD4＋T细胞数的相关性发现，CCL3L1基因拷贝数和病毒载量呈负相关（P＝0.000），CCL3L1基因拷贝数和CD4＋T细胞数呈正相关（P＝0.000），为探讨CCL3L1基因拷贝数对HIV／AIDS疾病进程的影响奠定基础。

本研究采用SYBR Green实时定量PCR检测CCL3L1基因拷贝数，实时荧光定量 PCR（Real time fluorescent quantitative PCR）是在PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，实时定量PCR能够实时监测产物扩增，在对数线性扩增期能够迅速、简便地检测PCR产物的扩增情况。本研究根据引物二聚体的CT值、产物及引物二聚体的熔解曲线分析和凝胶电泳对条件进行优化，确定了CCL3L1的最佳检测体系。通过优化反应条件我们发现，将读板温度设定在低于T值2－4℃可以提高扩增产物的特异性。就CCL3L1而言，读板温度设定为75℃，低于Tm值温度3℃，可以促使引物二聚体的双链变性，释放出结合的SYBR Green I，降低引物二聚体的荧光信号的同时，特异性扩增的PCR产物仍保持复性状态，其数量直接反映于荧光强度，从而增加检测的特异性。

当我们知道每个种族的平均CCL3L1平均拷贝数后，可以通过细胞因子CCL3L1基因拷贝数的不同，判断个体HIV－1易感性和疾病进展程度。通过对病人易感性的检测，可以帮助临床医生制订针对个体的治疗计划。并且通过CCL3L1基因拷贝数的不同，可以判定每个个体对疫苗的应答率。这也意味着CCR5配体基因产物对于HIV－1感染个体具保护性，CCL3L1基因拷贝数高者对HIV－1感染者的保护性越大。这项研究揭示了CCL3L1基因拷贝数个体的不同影响着HIV－1的感染过程，CCL3L1基因产物与HIV－1易感性密切相关。

［1］Modi WS.CCL3L1and CCL4L1chemokine genes are located in a segmental duplication at chromosome 17q12［J］.Genomics，2004，83（4）：735.

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