王淑荣，王晨光，齐首楠，苏冠方

（吉林大学第二医院 眼科，吉林 长春130041）

体外实验研究证明哺乳动物的视网膜干细胞（retinal stem cells，RSCs）具有自我更新的能力，并可被诱导分化成为多种类型的视网膜细胞，为治疗眼科领域内的致盲性眼底疾病带来了希望，在本实验中，我们应用含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的质粒对RSC进行转染，观察细胞表达后的生长情况及分化情况，为将来进一步应用基因修饰的RSC进行基因治疗及细胞治疗的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 出生10d的Wistar大乳鼠（体重约45 g），由吉林大学白求恩医学院动物实验中心提供。胎牛血清、DMEM／F12培养基、B27添加剂（Gibco），胰蛋白酶、G418、EDTA（Sigma），pGCsilencerTM U6／Neo／GFP（上海吉凯公司），BrdU、多聚赖氨酸，nestin、NSE、GFAP兔抗大鼠多克隆抗体，小鼠抗大鼠BrdU单克隆抗体，SABC、DAB试剂盒（武汉博士德公司），倒置相差显微镜（Olympus），CO2培养箱（SANYO）等。

1.2 方法

1.2.1 RSCs的分离、培养 断颈处死Wistar大乳鼠（出生10d的），应用750ml／L乙醇消毒5min，取出眼球，在角膜缘后约3mm处环形剪开，分离取出睫状体区组织，剪碎后应用含有0.5ml含有2.5 g／L胰蛋白酶及0.2g／L EDTA的消化液于37℃下消化15min，期间震荡3次。应用含有100ml／L胎牛血清的DMEM／F12培养液终止消化，离心弃上清后应用无血清培养液洗涤最终制成单细胞悬液，调整细胞密度为109／L，于37℃、50ml／L CO2、饱和湿度条件下进行培养，并添加20μg／L大鼠碱性成纤维生长因子（bFGF），20μg／L大鼠表皮生长因子（EGF）及1×B27添加剂。大约3d时半量换液，当细胞团较大时予以传代，传代应用含有2.5g／L胰蛋白酶及0.2g／L EDTA的混合消化液消化细胞。

1.2.2 RSCs的鉴定 应用免疫细胞化学法进行鉴定。细胞爬片预先经多聚赖氨酸处理，检测BrdU时……