郭洪亮，徐忠信

（1.首都医科大学附属北京朝阳医院 神经内科，北京100020；2.北华大学附属第一临床医院；3.吉林大学中日联谊医院 神经内科，吉林 长春130033）

在缺血性神经疾病的研究中，由于体内环境较为复杂，从体外实验模拟体内试验的研究愈来愈受到重视，因神经元是不可再生细胞，神经元的原代培养难度较大，最终可用于实验的数量、纯度均受到一定限制。本实验采用PC12细胞是由大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤分离并建立起的细胞系，其在体外经NGF刺激诱导后可向交感神经元分化，最终导致PC12细胞在生理、生化方面都具有神经元样的功能，同时应用体外氧糖剥 夺 （oxygen－glucose deprivation，OGD）来模拟体内脑缺血过程，为今后进一步探讨缺血缺氧状态下对神经元的活力、凋亡、信号通路机制的研究奠定物质基础。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

大鼠PC12细胞株购自北京金紫晶生物医药技术有限公司（中国医学科学院肿瘤细胞库）。鼠神经生长因子（NGF）（Sigma公司，美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 PC12细胞的培养、传代 将细胞悬液加入含有DMEM完全培养基，培养液2－3天更换一次。当细胞汇集至80%时进行传代接种。

1.2.2 鼠神经生长因子（NGF）诱导PC12细胞转化为神经元样细胞 PC12细胞培养1－2天，观察细胞贴壁后，用含NGF终浓度为50ng／ml的培养液进行培养。

1.2.3 PC12细胞转化为神经元的鉴定 （1）形态学观察 细胞培养板每日置于倒置显微镜下观察细胞胞体与突起形态、贴壁与生长情况。（2）免疫细胞化学染色鉴定 PC－12细胞分别在NGF培养液中培养24小时后，用NSE免疫细胞化学染色进……