李 丹，于 蕾，袁海波，丁 会＊

（1.吉林大学第一医院 呼吸科，吉林 长春130021；2.吉林大学白求恩医学院 生理学系）

本研究在发现有机汞具有多途径抗癌效应的基础上［1，2］，进一步探讨无机汞对小细胞肺癌（SCLC）细胞系NCI－H446细胞凋亡、凋亡相关基因mRNA转录水平和蛋白质表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人小细胞肺癌细胞株（NCI－H446）由吉林省肿瘤医院肿瘤研究所赠送。无机汞（IM）（德国，Merck公司），As2O3（美国，Alfar Aesar公司），顺铂（DDP）（山东齐鲁药厂）；DMEM细胞培养基（美国，Gibco公司）；TrizolRNA提取试剂盒（上海生物工程公司）；Taq DNA polymerase（大连宝生物工程公司）；AMV逆转录酶（美国，Sigma公司）；Rnasin RNA酶抑制剂（美国，Promega公司）；间隔100bp DNA分子量标尺，Oligo dT寡核苷酸T（大连宝生物工程公司）。

1.2 主要仪器 550型酶标仪，凝胶成像分析系统（美国，Bio－Rad公 司）；PCR 扩 增 仪 （美 国，PE 公司）；FACSAN流式细胞仪（美国，BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞 取对数生长期 NCI－H446细胞，用0.25%胰酶消化，配制成单细胞悬液，调细胞浓度为1×106／ml，接种至6孔培养板（5×105／孔）。细胞分为IM组、As2O3组、DDP组和对照组。待细胞完全贴壁以后，IM组每孔加入终浓度为5.0μmol／L的IM，终体积均为2.0ml；As2O3组、DDP组和对照组分别加入As2O3、DDP及培养液，终体积为2.0 ml。培养6、12、24、48h后，分别收集细胞。

1.3.2 RT－PCR Trizol法提取细胞总RNA 经紫外分光光度计检测RNA纯度良好后，RNA在AMV逆转录酶作用下合成cDNA。再以cDNA作为模板参与完成PCR反应。PCR扩增的条件为：94℃1min，57℃1min，72℃90s，35个循环，最后1次循环结束后，72℃延伸10min。根据基因cDNA序列设计 Bcl－2、Bax、Caspase－3和β－actin的 PCR引物（由上海生物工程公司合成）。Bcl－2引物序列：正向5′CGCTCTGTGGATGACTGAGT3′，反向5′GATTTGACCATTTGCCTGAAT3′，产 物 长 度389bp。Bax引物序列：正向5′ATTGGAGATGAACTGGATAGC3′，反向5′CCACAAAGATGGTCACTG3′，产物长度337bp［3］。Caspase－3引物序 列：正 向 5′GCACTGGAAT－GTCAGCTCGCAA3′， 反 向 5′ GCCACCTTCCGGTTAACACGAC3，产物长度556bp［4］。β－actin引物序列：正向5′TCTGGATCACCTTCTGCTGG3′，反向5′ATTGCTCAGGA－CATTTCTG3′，产 物 长 度 690 bp［5］。PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳后经凝胶成像系统分析结果。……