黄前川，杨长亮，曹军皓，丁进亚

（广州军区武汉总医院1.检验科；2.耳鼻喉科，湖北 武汉430070）

AP－2（activator protein 2）为一类转录因子家族，包括5个成员，即 AP－2α，β，γ，δ和ε，分子量约为52kDa，参与发育、分化和凋亡等生理过程［1］。已证实过度表达的HER－2是乳腺癌预后不良及药物治疗靶点［2］，HER－2基因启动子上有人 hAP－2α（human activator protein 2alpha，hAP－2α）的结合位点，因而 hAP－2α可以促进 HER－2基因转录［3］，免疫组化实验发现人乳腺癌组织中hAP－2α与HER－2表达明显正相关［4］，可见 hAP－2α高表达是乳腺癌一个重要的分子标志。最近几年的研究发现一些hAP－2α结合蛋白参与hAP－2α介导的乳腺癌病变过程。这些蛋白包括 DEK［5］和 Yin Yang 1［6］等。它们本身不是转录因子，但是可以结合转录因子而增强其转录活性。本实验旨在构建hAP－2α转录因子酵母双杂交诱饵载体，为进一步系统分析hAP－2α及其相互作用蛋白在乳腺癌发生机制中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 酵母双杂交系统的诱饵表达载体质粒pGBKT7、系统阳性对照质粒pGBK7－53，阴性对照质粒pGBKT7－Lam和酵母工程菌株AH109均购自美国Clontech公司；大肠埃希杆菌DH5α为本实验室保存菌株；宫颈癌Hela细胞株由武汉大学基础医学院提供；T4DNA连接酶购自美国Promega公司；限制性内切酶、MulV Reverse Transcriptase均购自加拿大Ferments公司；Trizol试剂购自美国Invit rogen公司；Myc单克隆抗体购自碧云天生物技术研究所；引物由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 hAP－2α表达序列的克隆 常规培养和传代宫颈癌Hela细胞株，使用Trizol裂解法提取细胞总mRNA，逆转录合成cDNA；取1μl cDNA为模板，依次在PCR反应体系中加入反应物：10×缓冲液2.5μl、dNTP 0.5μl、hAP－2α引物各（50mmol／L）0.5μl、Taq酶 0.5μl和ddH2O 19.5μl；PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃30s，63℃35s，72℃50s，循环30次；72℃10min。引物设计如下：3’－CGGAATTCATGCTTTGGAAATTGACG G－5’，3’－AGTCGACTCACTTTCTGTGCTTCTC CT－5’，分别在两端引入酶切位点SalⅠ和EcoRⅠ；……