王玉田，张丽艳，张国莹

（1.辽宁医学院食品科学与工程学院，辽宁锦州121001；2.本溪市产品质量监督检验所，辽宁本溪117000）

低温灌肠制品中苦瓜皂甙抑菌模型的建立

王玉田1，张丽艳2，*，张国莹2

（1.辽宁医学院食品科学与工程学院，辽宁锦州121001；2.本溪市产品质量监督检验所，辽宁本溪117000）

用Gompertz方程对低温灌肠制品冷藏期的特定菌生长曲线进行拟合，模拟Ratkowsky方程腐败菌生长动力学温度模型，建立低温灌肠制品中苦瓜皂甙抑菌模型，对苦瓜皂甙抑菌模型进行数学检验。结果表明，修正的Gompertz方程对接种后低温灌肠制品中特定菌生长曲线拟合性较好。通过苦瓜皂甙抑制模型可得大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌可耐受的苦瓜皂甙最高浓度分别为212.735、186.103、170.251mg/kg。抑菌模型经数学检验证明，模型的适用性、准确性和拟合性均在可接受的范围内，有应用价值。

苦瓜，皂甙，抑菌模型

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜猪肉（肥瘦比1∶3）、猪小肠衣、乳酸钠、异抗坏血酸钠、复合磷酸盐、食盐、淀粉、调味料 均市售；苦瓜皂甙 本实验室提供；LB营养肉汤培养基；TYGA液体培养基；菌种：埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌 本实验室提供。

电热恒温鼓风干燥箱、恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；热空气消毒箱 北京六一仪器厂；超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司；电热手提式压力蒸汽消毒器、电热恒温水浴锅 北京瑞帮兴业科技有公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蒸煮香肠制作 将鲜肉去除污物、筋骨后。肥瘦分开，绞碎（绞肉过程中加入适量的冰屑以降低温度），瘦肉加入400mg/kg异抗坏血酸钠以及3.9%的食盐，肥膘只添加3.0%的食盐，置于（2±2）℃的范围内腌制24h。腌制完毕进行斩拌，同时加入辅料及规定量的苦瓜皂甙，灌制后在恒温炉（65~70℃）中烘烤50min，放入水浴锅（95℃）内，温度逐渐降至80~85℃后，加热50min，出锅后用白砂糖熏制50min后，用市售保鲜膜包装，另做一个不加苦瓜皂甙的空白对照，一同冷藏保存。

1.2.2 细菌接种 不同苦瓜皂甙添加量的四组蒸煮香肠（0、30、60、120mg/kg）冷藏前每组分为三份，除对照外分别接种埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌。细菌接种均采用针管注射法，参照Fenlon[6]等、Desmarcherlier[7]等和Birzele[8]等的方法。样品接种量均为1.5×103~1.5×104cfu/g。

1.2.3 细菌计数 在蒸煮香肠冷藏期间，每隔3d随机取样，参照GB/T 4789分别测定菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌（参照Yetim等[9]和高尚先等[10]的方法）的数量。

1.2.4 细菌生长的动力学模型和参数估计（一级模型） 将每隔3d取样得到的实验数据，分别用修正的Gompertz方程描述生长动态，用非线性最小二乘法进行拟合。估计生长曲线的最大比生长率（μmax）和迟滞期（λ）。修正的Gompertz方程如下：

式（1）中：t为时间（d）；N（t）是t时的微生物数量[lg（cfu/g）]；N0是t=0时的初始微生物量[lg（cfu/g）]；Nmax是增加到稳定期时最大微生物数量[lg（cfu/g）]；μmax是微生物生长的生长率（d-1）；λ是微生物生长的迟滞期（d）；t是时间。

1.2.5 苦瓜皂甙抑菌模型的建立（二级模型） 模拟温度对微生物生长影响的动力学模型Ratkowsky方程，建立苦瓜皂甙抑菌模型，用非线性最小二乘法进行拟合。Ratkowsky方程如下：

式（2）、（3）中，N是苦瓜皂甙浓度（mg/kg），Nmax和Nmaxλ是一个假设概念，指的是微生物没有代谢活动时的苦瓜皂甙浓度，即此时微生物生长率为零、迟滞期为无限长，b为常数。

1.2.6 苦瓜皂甙抑菌模型的可靠性评价 模型的适用性和可靠性需要经过数学评价才能推广到实际应用[11]。将建立的苦瓜皂甙抑菌模型对目标菌生长参数（μmax和λ）的预测值，与蒸煮香肠中目标菌生长曲线的生长参数（μmax和λ）的估计值进行比较，应用平方根误差（RMSE）、Baranyi[11]和Ross[12]等报道的准确因子（Af）和偏差因子（Bf），进行数学检验，评价建立的苦瓜皂甙抑菌模型的可靠性。偏差因子用来检验预测值的上下波动幅度，即偏差度；准确因子用来衡量预测值和实测值之间的差异，即准确度。

式（4）~式（6）中，obs为用修正的Gompertz方程拟合蒸煮香肠中特定菌生长曲线的生长参数μmax或λ观测值（一级模型）；pred为用建立的苦瓜皂甙抑菌模型对μmax或λ的预测值（二级模型）。

2 结果与讨论

2.1 细菌生长的动力学模型和参数估计（一级模型）

图1 冷藏期间不同苦瓜皂甙添加量的蒸煮香肠中菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌的数量变化情况Fig.1 The counts of aerobic bacteria，coliform bacteria，Staphylococcus and C.sporogen-es of cooked sausage with different saponins additions during cold storage

不同苦瓜皂甙添加量的香肠在冷藏期间的菌落总数、大肠菌群、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌数目（如图1）。苦瓜皂甙的抑菌作用随着添加量的增加而增强，在整个冷藏期间（0～30d）供试菌的生长均受到抑制。苦瓜皂甙添加量为120mg/kg的处理组与未添加组之间比较，在30d时，大肠菌群的菌数差异显著（p＜0.05），金黄色葡萄球菌和厌氧菌生孢梭菌菌数差异极显著（p＜0.01）。

应用修正的Gompertz方程对蒸煮香肠冷藏期间的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌生长曲线进行拟合，对生长曲线的生长率（μmax）和迟滞期（λ）进行参数估计见表1。结果表明苦瓜皂甙的添加量越大，三种菌的生长率越低、迟滞期越长，这与用观测值绘制的生长曲线结果相同，表明苦瓜皂甙的显著抑菌作用。同时，修正的Gompertz方程能够较好的拟合不同条件下生孢梭菌的生长状况，这与Graham等[13]的研究结果一致。

表1 应用Gompertz方程拟合求得的特定菌生长曲线的生长参数Table 1 The parameters growth rate（μmax）and lag time（λ）of coliform bacteria，Staphylococcus and C.sporogenes obtained from modified Gompertz function

2.2 苦瓜皂甙抑菌模型的建立（二级模型）

应用式（4）和（5）拟合苦瓜皂甙抑制大肠菌群、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌的二级模型。结果见图2、图3和图4。得到苦瓜皂甙抑菌的二级方程：大肠菌群如式（6）和（7），金黄色葡萄球菌如式（8）和（9），生孢梭菌如式（10）和（11）。

图2 苦瓜皂甙抑制大肠菌群的二级模型Fig.2 Secondary model of Coliform bacteria inhibition from Momordica saponins

结果表明，苦瓜皂甙抑菌模型的拟合性高低顺序为：金黄色葡萄球菌＞大肠菌群＞生孢梭菌。Nmax参数值指微生物没有代谢活动时的苦瓜皂甙的浓度，即在此浓度时生长率为零、迟滞期为无限长，因此三种菌耐受苦瓜皂甙的最高浓度分别为：大肠菌群是212.735mg/kg；金黄色葡萄球菌是186.103mg/kg；生孢梭菌是195.714mg/kg。

图3 苦瓜皂甙抑制金黄色葡萄球菌的二级模型Fig.3 Secondary model of Staphylococcus inhibition from Momordica saponins

图4 苦瓜皂甙抑制生孢梭菌的二级模型Fig.4 Secondary model of C.sporogenes inhibition from Momordica saponins

2.3 苦瓜皂甙抑菌模型的可靠性评价

2.3.1 验证用蒸煮香肠中特定菌的生长参数估计与预测 分别制作三组蒸煮香肠（苦瓜皂甙含量45、75、110mg/kg），其主要原辅料组成与建立抑菌模型的实验样品一致，每组分为三份，分别接种埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌。接种生孢梭菌的实验组需经过真空包装。细菌接种均采用针管注射法（同方法1.2.2），相同条件下取样检测菌数（同方法1.2.3），通过MicroFit软件拟合生长曲线，并对μmax和λ进行参数估计，结果见表2。

表2 应用修正的Gompertz方程拟合求得的用于验证的实验样品中供试菌的生长参数Table 2 The parameters growth rate（μmax）and lag time（λ）of coliform bacteria，Staphylococcus and C.sporogenes obtained from modified Gompertz function

用建立的苦瓜皂甙抑菌模型（二级模型）对验证用蒸煮香肠中特定菌生长参数μmax和λ进行预测，结果如表3所示。验证用蒸煮香肠中，观测到的特定菌的生长率（μmax）比抑菌模型预测值低，而观测到的特定菌的迟滞期（λ）比抑菌模型预测值高，这说明建立的抑菌模型属于Fail-safe类型。如果将建立的预测模型应用于实际生产中，将会出现“预测结果比实际情况严重”的现象，大大保证了产品的安全性，这样的模型可以放心使用。

表3 应用建立的苦瓜皂甙抑菌模型对验证用蒸煮香肠的特定菌生长参数预测Table 3 Predictions of growth rate（μmax）and lag time（λ）of coliform bacteria，Staphylococcus and C.sporogenes obtained from secondary model Momordica saponins inhibition

2.3.2 苦瓜皂甙抑菌模型数学检验 对苦瓜皂甙抑菌模型进行数学检验结果见表4，对生长率的预测RMSE都低于1.0，而迟滞期的RMSE较高，由此说明生长率的预测准确性高。偏差因子（Bf）检验结果表明，三种特定菌的Bf值都在1.0左右，可见苦瓜皂甙抑菌模型属于可接受类型。准确性因子（Af）值越大表示平均准确性越低，而Af值等于1表示预测值与观测值之间完全吻合。结果显示，大肠菌群和金黄色葡萄球菌的Af值较低，而生孢梭菌的Af值相对较高，表明建立的苦瓜皂甙抑菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的模型准确性较高。本文建立的预测模型经检验适用性好，拟合性好。食品处于实际环境中其结构在某种程度上对微生物的生长行为产生影响，环境的复杂性远高于实验条件下的研究，因此抑菌模型计算出来的值比实际食品环境中偏大。

表4 苦瓜皂甙抑菌模型的数学检验Table 4 Mathematical validations of secondary model Momordica saponins inhibition

3 结论

苦瓜皂甙作为天然植物防腐剂，对金黄色葡萄球菌、大肠菌群和生孢梭菌均有明显抑制作用。修正的Gompertz方程对香肠冷藏期间的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和生孢梭菌生长曲线的拟合性较好。通过Ratkowsky平方根经验模型拟合的抑菌模型得到三种菌耐受苦瓜皂甙的最高浓度为212.735、186.103、170.251mg/kg。对苦瓜皂甙抑菌模型进行数学检验，模型的适用性、准确性和拟合性均在可接受的范围内，苦瓜皂甙抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的模型准确性较高。

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Establishment of bacteria inhibition model by saponins in lowtemperature sausage

WANG Yu-tian1，ZHANG Li-yan2，*，ZHANG Guo-ying2
（1.Food Science and Technology College，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China；2.Product Quality Supervision and Inspection Institution of Benxi，Benxi 117000，China）

The growth curves of certain bacteria were fitted by modified Gompertz，then establishment and validation of bacteria inhibition model from saponins in low-temperature enema products by forecast microbiology.The investigation of establishment and validation of bacteria inhibition model from saponins in low-temperature enema products indicated that the growth curves of coliform bacteria.The highest enduring concentrations of Escherichia coli，Staphylococcus aureus and Clostridium sporogenes to saponins were lower than 212.735，186.103，170.251mg/kg，respectively.The result of evaluation of mathematical parameters indicated that root-mean-squares error（RMSE），bias factor（Bf）and accuracy factor（Af）were within acceptable range and bacteria inhibition model was value for application in low-temperature enema products.

Momordica charantia L；saponins；bacteria inhibition model

TS251.6+5

A

1002-0306（2012）03-0117-04

苦瓜（Momordica Charantia L.）为葫芦科苦瓜属植物，性味苦寒，具有清热解毒、滋养强壮等功效[1]。现代医学证明，苦瓜具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等药理作用。并且苦瓜皂甙对高血糖有协同预防作用[2]。国内外研究[3-5]已证实，苦瓜汁具有免疫调节、广谱抗菌作用，苦瓜种仁蛋白和苦瓜皂甙对啤酒酵母菌、米曲霉菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显抑制作用。为进一步开发利用苦瓜资源，本实验对苦瓜皂甙在低温灌肠制品中的防腐作用做了一些研究并建立抑菌模型，以讨论其作为天然防腐剂的前景。

2011－03－14 *通讯联系人

王玉田（1953-），男，硕士，教授，研究方向：畜产品质量与安全工程。

辽宁省工程中心基金项目（2010402004）。