华承伟，谢凤珍，于江傲

（1.河南科技学院生命科技学院，河南新乡453003；2.河南科技学院新科学院，河南新乡453003）

一种酿酒酵母表达CDNA文库分离纤维质降解酶系基因的方法

华承伟1，谢凤珍2，于江傲1

（1.河南科技学院生命科技学院，河南新乡453003；2.河南科技学院新科学院，河南新乡453003）

目的：建立一种筛选自然界产纤维质降解酶系基因的新方法。方法：对酿酒酵母表达载体pYES2多克隆位点加入真核生物稀有限制性酶切位点SfiI进行改造，利用SMART技术，以大肠杆菌文库为转导，构建了拟青霉（Paecilomyces sp.H28）的酿酒酵母全长cDNA表达文库。结果：利用纤维质-刚果红染色法从文库筛选到多种纤维素和半纤维素降解酶系基因。结论：成功构建了拟青霉的酿酒酵母表达cDNA文库，加快了纤维质降解酶系基因的快速分离，也为其它相关基因的快速分离提供了有益的借鉴。

酿酒酵母，表达cDNA文库，纤维质降解酶，分离，拟青霉

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

拟青霉（Paecilomyces sp.H28） 由河南科技学院分离工程实验室筛选并保藏；酿酒酵母INVSc1（Saccharomyces cerevisiae）及载体pYES2 Invitrogen；Escherichia coli strain JM109 Stratagene；无氨基酸酵母氮源（Yeast Nitrogen Base without Amino Acids，YNB） Difco；酵母提取物、胰蛋白胨 Oxoid；桦木木聚糖 Sigma；TRIzol ReagentInvitrogen；Oligotex mRNA Mini Kit Qiagen；PrimeScript Reverse Transcriptase（RNase H-），Advantage 2 PCR KitTaKaRa；T4 DNA连接酶及其它限制性内切酶 NEB；质粒提取试剂盒 北京天根生化科技；其它试剂 均为分析纯。

1.2 pYES2载体的改造

1.2.1 寡核苷酸单链合成 根据pYES2载体酶切位点，分别合成内部具有EcoRI酶切位点且两端带有HindIII和XhoI两个酶切位点粘末端及两端分别引入SfiI A及SfiI B酶切位点的末端磷酸化的寡核苷酸链。

1.2.2 双链DNA合成 用STE缓冲液溶解两条寡核苷酸链，浓度为100μmol/L，分别取等体积的两链溶液50μL混合，置于PCR仪上95℃加热10min，然后缓慢冷却到室温，产物于4℃暂时贮存或-70℃保存。……