刘小会，淡松松，秦焕焕，高学娟，刘朗夏

（暨南大学生命与健康工程研究院，广州510632）

PCNA蛋白突变体的真核表达载体构建及鉴定＊

刘小会，淡松松，秦焕焕，高学娟△，刘朗夏

（暨南大学生命与健康工程研究院，广州510632）

目的 构建带FLAG标签的细胞增殖核抗原（PCNA）蛋白Y211A、Y211D突变型重组质粒，真核表达及鉴定。方法 以FLAG－PCNA野生型基因为模板，运用PCR定点突变技术扩增出带突变位点的基因序列，将其插入真核表达载体pCMVN－FLAG，进行双酶切实验和测序验证。然后，利用脂质体将重组质粒转染至293T细胞，Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果 FLAG－PCNA（Y211A）、FLAG－PCNA（Y211D）重组质粒测序结果正确，获得PCNA蛋白突变体。结论 成功构建了带FLAG标签的PCNA蛋白Y211A、Y211D真核表达载体，验证了突变型PCNA融合蛋白的表达，为PCNA蛋白功能的深入研究奠定了基础。

PCNA蛋白；突变体；真核表达

细胞增殖核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是一种在增殖细胞中合成或表达的核抗原，相对分子质量约为36×103，是真核细胞DNA聚合酶δ的辅助因子，与DNA合成和细胞增殖相关，是近年来认为更能有效评估肿瘤细胞增殖活性的重要标志物，也是当前研究的热点之一［1－3］。

许多文献曾报道，表皮生长因子受体（epithelial growth factor receptor，EGFR）在细胞增殖与肿瘤分化中发挥着重要作用。Shao－Chun Wang博士报道EGFR可以磷酸化PCNA上的Y211位点，减少PCNA的降解，从而促进细胞增殖、参与DNA损伤修复［4－6］。本研究运用PCR定点突变技术将211位酪氨酸碱基TAC分别突变成丙氨酸碱基GCC、天冬氨酸碱基GAC，以获得突变型PCNA蛋白基因。将构建的pCMV－NFLAG－PCNA Y211A和Y211D重组质粒，分别转染至293T真核细胞，对表达的融合蛋白进行鉴定，为进一步探讨PCNA蛋白在肿瘤细胞中的生物学作用提供实验基础。……