董维平 丁晓颖 蔡锦全 彭永德 王煜非 谭建明

胰岛移植后，胰腺内分泌功能得到部分恢复，胰岛 α 细胞分泌的胰高血糖素和胰腺 PP细胞分泌的胰多肽都可参与血糖的调控，内源性胰岛素的分泌也使C肽的分泌恢复了正常[1-2]。胰岛移植不仅能纠正糖尿病患者的代谢异常，并能防止微血管病变的发生与发展，是治疗1型糖尿病的理想方法[3-6]。胰岛移植临床开展的前期，往往需要进行动物实验，由于实验大鼠较易得到且胰腺消化纯化胰岛方法简单，故应用较广泛；随着对糖尿病研究的深入和分子生物学的发展，也常常需要纯的胰岛供实验用。但胰岛分离受诸多因素的影响，特别是消化酶溶液的pH和纯化溶液的比重，直接影响到胰腺的消化和胰岛的纯化，导致胰岛得率差异甚大。本研究借鉴成人胰岛分离方法，采用商品化的试剂，以免除试剂配制的差异，并对纯化胰岛的得率和功能进行比较。拟建立稳定的大鼠胰腺原位胆总管胶原酶灌注消化，Ficoll纯化的胰岛分离方案。

材料和方法

一、材料

1.试 剂：胶 原 酶 P（瑞 士 Roche公 司），Hank、HEPES（1mol/L）液、Ficoll / Eurocollins溶液 1.132、1.108、1.096和 1.037（美国 Mediatech公司），NaOH 液（美国 Hampton Research公司），10﹪ 氯化钙液（American Phamaceutical Partners），新生牛血清、胎牛血清（美国Gibco公司）。

2.动物：成年雄性SD大鼠24只，体重300～ 500 g（上海市实验动物中心）

二、方法

1.分组：将购入的大鼠按体重从高到低编号，单号为对照组，双号为标准组。

2.胶原酶溶液的配制：对照组：采用以前的方法[7]，自行配制含 7.5 mmol/L CaCl2、20 mmol/L HEPES、pH7.8 的 Hank 液；标准组：Hank 500 ml，加 1 mol/L 浓度的 HEPES 液 12.5 ml、1 mol/L 浓度的 NaOH 液 2 ml、10﹪ 氯化钙液 4 ml。临用前加胶原酶P配制成1 mg/ml的胶原酶溶液，0.2 μm孔径的针头滤器过滤除菌。

3.胰腺消化：大鼠戊巴比妥腿部肌肉注射麻醉，消毒后沿胸廓下缘行T型切口暴露腹腔，用丝线结扎12指肠侧胆总管，5#头皮针胆总管逆行穿刺后用丝线结扎固定，破心放血，用蚊式钳夹住肝侧胆总管，胆总管内注入10 ml胶原酶溶液。迅速摘取胰腺置 30 ml锥型烧瓶中（内预加 6 ml Hank 液），于 38℃水浴静止消化 10 min，取出后振摇使呈细沙状，500 μm孔径不锈钢丝网过滤至预加10 ml小牛血清的烧杯中，用冷Hank液冲洗丝网，滤过液于 200 ×g、2 min 4℃离心沉淀，弃上清，用含10﹪新生牛血清的Hank液洗2次,混匀后取样，双硫腙染色后于倒置显微镜下，选用4倍物镜计数胰岛（图1）。

图1 大鼠胰腺经胶原酶消化后经双硫腙染色，在倒置显微镜下可以清楚鉴别胰岛（×10）

4.胰岛纯化：对照组：沉淀加25﹪的Ficoll/Hank 溶液 4 ml，混匀后依次缓慢加入 23﹪、21﹪和11﹪的Ficoll溶液各2 ml；标准组：沉淀加比重 为 1.132 的 Ficoll/Eurocollins溶液 4 ml，混 匀后依次缓慢加入比重为1.108、1.096和1.037的Ficoll/Eurocollins溶液各 2 ml。2000 ×g、4℃水平离心20 min，对照组吸取 21﹪和23﹪上界面的细胞团、标准组吸取1.108和1.096上界面的细胞团，Hank液洗涤，取样作胰岛计数和纯度鉴定，加含 20﹪ 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液 37℃培养。

5.胰岛计数和活率检查：双硫腙染色后于倒置显微镜下，选用4倍物镜计数胰岛、同时目测估计胰岛的纯度；吖啶橙-碘丙啶双色荧光染色计数胰岛的活率[8]。

6.胰岛功能检测：消化、纯化后胰岛培养2 d做胰岛素释放试验：于低糖（2.8 mmol/L）无血清1640培养液和高糖（16.7 mmol/L）无血清1640培养液中各37℃培养2 h，检测培养液中胰岛素含量。

三、统计学分析方法

采用SPSS19.0进行统计学处理,胰岛得率、活率和胰岛功能指标采用表示；各指标对照组与标准组间的差异采用独立t检验分析，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结  果

两种方法消化后胰岛的数量无显著性差异（P= 0.935）；纯化后标准组胰岛的得率与对照组比较，差异无统计学意义（P=0.438）；两组胰岛的活率亦无统计学差异（P=0.275, 表1）；两组胰岛的纯度均为 85﹪ 以上（图2）。

高糖下胰岛素释放试验标准组高于对照组，差异有统计学意义（P=0.036）；但低糖组的胰岛素和释放指数的差异均无统计学意义（见表 2）。

表1 两组实验大鼠胰腺经不同方法消化结果比较（±s）

表1 两组实验大鼠胰腺经不同方法消化结果比较（±s）

组别 动物（只）胰岛得率 活率（﹪）消化后 纯化后对照组 12 888 ± 115 562 ± 105 92.8 ± 5.3标准组 12 891 ±  53 590 ±  88 94.7 ± 2.1 t值 0.082 0.708 0.064 P值 0.935 0.438 0.275

表2 两组实验大鼠胰腺经不同方法消化结果胰岛的功能比较（±s）

表2 两组实验大鼠胰腺经不同方法消化结果胰岛的功能比较（±s）

胰岛功能(pmol/胰岛) 释放指数低糖 高糖对照组 12 5.3 ± 1.9 12.8 ± 4.0 2.50 ± 0.52标准组 12 6.4 ± 1.5 16.4 ± 3.9 2.57 ± 0.17 t值 1.574 2.232 0.443 P值 0.130 0.036 0.662组别 动物（只）

图2  在倒置反射式荧光显微镜下观察小鼠纯化后胰岛经AO-PI双色荧光染色后计数胰岛活率

讨 论

成年大鼠胰岛分离主要有原位胰腺内胶原酶灌注消化和Hank液灌注后剪碎胰腺，再加胶原酶消化两种方法。胰腺内胶原酶灌注不仅可通过物理的作用破坏腺泡结构，使其破碎而增加比重，从而保证胰岛在密度梯度离心时与腺泡细胞分离；同时胶原酶从胰岛外部作用首先消化胰岛包膜而使胰岛脱落，除保持了胰岛的完整性，也保持了腺泡细胞的完整。陈创奇等[9]研究结果也证明原位胰腺内胶原酶灌注消化的方法能够得到最高的胰岛得率。

在消化过程中，腺泡细胞一旦破坏，细胞内的大量消化酶释放出来，极易产生一种黏稠的胶状物，其内可含大量的胰岛细胞，不利于胰岛细胞的纯化提取[9]。这种胶状物一旦形成，即使通过稀释、搅拌、吹打、过滤等方式都不能将胰岛释放出来，从而影响胰岛的得率[10]。Burghen和Murrell[11]曾报道，胶原酶溶液pH 7.8、38℃消化，可明显减少胶状物的产生。参照他们的方案，建立了胆总管内逆行灌注胶原酶消化、Ficoll密度梯度分离纯化的大鼠胰岛消化分离方法[7]。但是，消化溶液的pH在配制时难免有差异，因此，胰腺的消化结果常不稳定。采用成品试剂可避免这种差异，本组资料两组消化和纯化后胰岛的数量差异虽没有统计学意义，但标准组的标准差明显小于对照组（891 ± 53 比 888 ± 115 和 590 ± 88比 562 ± 105），表明采用成品试剂配制的消化结果更稳定。

成年动物的胰腺内胰岛仅占1﹪～2﹪，必须经过纯化的步骤把胰岛分离出来。常用的纯化方法是密度梯度离心法，而Ficoll因其对细胞毒性较小而常作为纯化剂的首选。细胞在缺氧的状态下因肿胀而容易破碎，高渗溶液可减轻细胞的肿胀，有利于保护细胞[12-13]。因此，我们选用Ficoll / Eurocollins溶液。在纯化的过程中，不但纯化剂的比重会影响纯化的结果，纯化剂的渗透压也会通过影响细胞内水份的含量而改变细胞的比重，从而影响纯化的结果。自行配制的Ficoll液很难保证比重和渗透压每次配制都一致，因此而影响了胰岛分离结果的稳定性。本组资料两组的胰岛功能比较，标准组的低糖、高糖和释放指数均高于对照组［（6.4 ± 1.5）pmol/ 胰岛、（16.4 ± 3.9）pmol/胰 岛 和（2.57 ± 0.17)倍 比（5.3 ± 1.9）pmol/胰岛、（12.8 ± 4.0）pmol/胰岛和（2.50 ± 0.52）倍］，由于样本量较小（n= 12），只有高糖释放的胰岛素有统计学意义。

大量的研究证明[14-16]，胰岛移植早期移植物的失活与移植物内含有内毒素等致敏原有关，而这些致敏原主要来自于胰岛分离的试剂中。自行配制的试剂虽然可以通过高温、过滤等方法去除细菌，但无法去除溶液中的内毒素。采用低内毒素的商品化试剂，可减少移植物的失活，从而提高胰岛移植的效果。

本研究提示，应用标准化的胰岛分离方案，可减少实验误差、利于尽快掌握分离技术，保证胰岛的得率和功能。特别是进行胰岛移植实验时，标准化的胰岛分离方案可提高移植效果，保证实验的可靠性。

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