陶然 李进 张克 马世武 姜维 李溢柔 周向军

特异性细胞免疫反应是机体清除感染病毒和变异细胞的主要机制，体内特异性细胞免疫反应的启动需要抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APC），主要包括树突状细胞（dendritic cells，DC）对抗原的递呈[1-2]。慢性乙肝患者体内针对乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）的特异性免疫应答低下，DC功能障碍（如捕获抗原能力下降或成熟受阻等）被认为是主要原因之一[3-5]。本研究探索了用携带有HBV核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）基因的重组腺病毒 CHB3体外感染DC进行抗原负载的方法和效果，为慢性乙肝患者体内免疫反应低下提供解决方案。

材料和方法

一、实验材料

1.研究标本：健康志愿者，知情告知并签署知情同意书，肝素钠抗凝管抽取外周静脉血50 ml。

2.主要试剂：淋巴细胞分离液（美国Hyclone公司）；GM-CSF、IL-4、Cocktail、IL-2(美国PeproTech公司)；1640培养液，AIM-V培养液（美国Invitrogen公司）；PAA淋巴细胞培养液（德国PAA公司）；CD86- FITC、CD83- PE、CD80- PEcy5、HLA-DRFITC、CD14-APC、CCR7-PE、FITC羊抗鼠荧光二抗（美国BD公司）；HBcAg-pentamer-PE检测试剂（美国Proimmune公司）。

二、实验方法

1.外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）的分离及 DC 的体外培养：700 ×g离心 20 min 分离血浆，剩余血应用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）1:3稀释后，淋巴细胞分离液分离PBMC，细胞计数，用RPMI1640基培重悬细胞，调整细胞密度为 5 × 106个 /ml，接种于 24 孔板中，每孔接种1 ml，然后置于 37℃、5﹪CO2培养箱内静置培养，1.5 h后，在超净工作台内，吸除未贴壁细胞，并应用无菌杜氏磷酸缓冲液（dulbecco's phosphate buffered saline，DPBS）液洗涤细胞 3 次，最后加入 rhGM-CSF( 800 U/ml）、rhIL-4( 400 U/ml）、青霉素 100 U/ml、链霉素 100 U/ml，并分别用 2﹪ 自体血浆（autologous plasma，AP）的 RPMI1640 完全培养基（或 AIM-V）0.5 ml，37℃、5﹪CO2培养箱内培养。10 h后，吸除上清，并用RPMI1640基培洗涤细胞3次，最后应用上述加入细胞因子、抗生素和含有 2﹪AP的RPMI1640完全培养基（或AIM-V）1 ml，37℃、5﹪CO2培养箱内培养。体外培养的第3、5天半量换液。……