刘尧娟，邹家琦

（1.天津市第一中心医院移植中心，天津 300192；2.国家卫建委危重病急救医学重点实验室，天津 300100）

胰岛移植（islet transplant）是一种β 细胞替代疗法，主要用于治疗反复发作低血糖的1 型糖尿病，可以安全、有效的维持患者血糖平衡，防治糖尿病相关的严重并发症的发生和发展，是一种能够恢复生理血糖控制且微创的治疗方法。血糖控制是糖尿病相关慢性并发症的关键因素。成功的胰岛移植是使受者实现糖代谢正常，脱离外源性胰岛素，使糖化血红蛋白水平（haemoglobin A1c，HbA1c）恢复正常，减轻糖尿病诱导的器官衰竭以及降低因使用外源性胰岛素导致严重低血糖事件危及生命的风险，进而改善受者生活质量。近年来，国内外胰岛移植治疗糖尿病取得长足进步[1，2]，其中埃德蒙顿方案将来自多个捐献者的高质量胰岛与无糖皮质激素的免疫抑制剂治疗相结合，取得了较好的临床疗效，成为临床胰岛移植里程碑[3]。据报道[4]，40%～50%的患者在胰岛移植后5 年仍然无需注射胰岛素。人类胰腺中胰岛数目在30 万～150 万。在目前的临床制备技术下，一个胰腺内只有30%～50%的胰岛被分离出来，因此提高胰腺分离是非常有必要的。尽管胰岛移植在临床结果方面取得了进展，但获得足够量移植胰岛、提高移植疗效仍然是一个具有挑战性的过程。其中，胰岛制备是提高临床胰岛移植长期疗效的关键。本文从供体筛选、胰岛分离过程、移植前培养等方面阐述影响胰岛制备的因素，以期为临床提高胰岛分离产量提供参考。

1 供体体征对胰岛产量的影响

在胰岛移植过程中，大约30%的治疗费用与胰岛制备有关[5]，表明有效利用胰岛资源至关重要。胰岛移植发展的20 多年来，优化供体选择以增加胰岛的产量和质量，以更少的供体胰腺获得更多的胰岛一直是临床的难点及重点。国内外许多研究均探讨过供体因素与胰岛产量之间的相关性[6，7]，其中体重、身高和身体质量指数（body mass index，BMI）是与胰岛产量和质量相关性较高的供体特征[8-11]。Pilla SJ等[10]对芝加哥伊利诺伊大学芝加哥分校单中心的276 例胰岛分离研究中发现，供体BMI 与胰腺大小、实际胰岛数（actual islet count，AIC）、胰岛当量（islet equivalent，IEQ）呈正相关，而冷缺血时间（cold ischemia time，CIT）与AIC、IEq/g 呈负相关，但BMI和CIT 与胰岛大小分布没有相关性。另有研究发现[6]，供体年龄并不影响胰岛产量，但＜45 岁或更年轻供体患者的胰岛移植功能参数均显著升高。Briones RM等[12]研究报道，男性供者分离获得足够胰岛供移植的概率明显更高。此外，Denise E 等[13]研究报道，脑死亡供者与心脏死亡供者相比，脑死亡供者的胰岛产量较低，提示供者死亡原因对胰岛制备的结果同样具有一定的影响。

基于不同因素对获取胰岛的影响，2005 年Gorman等首次提出了胰岛供体评分（Islet Donor Score，IDS）系统，并成功地将其用于胰岛制备的最佳胰岛/供体选择中[8，14]。该评分系统涉及详细的捐献者资料，包括年龄、体重、身高、BMI、体表面积、胰腺重量、死亡原因（大脑或心脏)、住院时间、是否使用升压药、血糖控制和冷缺血时间等[15]。基于多变量分析，该方法确定了最重要的供体因子，并进行了相应的加权。IDS 系统的使用有助于以更客观的方式评估复杂的供体信息，是标准化胰岛供体分离的第一个重要部分。IDS 作为评分系统在埃德蒙顿开发，并在其他中心进行验证[8]，目前已成为许多中心选择供体和预测胰岛分离结果的重要工具。2016 年，北美11 家研究中心通过分析1056 例胰岛制备的供体特征，进行胰岛供体评分，获得了成功胰岛分离的预测变量，并建立了北美胰岛评分系统（North American Islet Donor Score，NAIDS）[15，16]。NAIDS 评分系统提示通过预估供体评分，可以提高胰岛制备成功率，该评分系统作为一种有用的供体胰腺评估工具，可以优化供体选择。因此，在移植术前对供体进行详细评估，并制定相应的方案，可以提高获取胰岛的质量和数量。

2 胰岛分离过程对胰岛产量的影响

优化胰岛分离过程是提高胰岛产量和质量的有效方法。成功的人胰岛分离对临床及基础研究应用至关重要，其在很大程度上受胰腺消化酶选择的影响，因此不断开发和使用高质量的酶是胰岛分离的关键因素。由于每个供体胰岛的细胞外基质和基底膜成分存在个体差异性，以致于胰岛分离的组织解离酶（即胶原酶和蛋白酶）的功效受影响，这也是胰岛分离难以实现标准化的原因之一。近年来胶原酶的改进经过了精炼和纯化的过程，内毒素污染的减少和批次间差异的缩小是胶原酶改进的重要进步之一[17]。然而，单独使用纯化的胶原酶而不补充酶混合物，会导致胰腺消化不足。这些额外加入的蛋白酶对胰岛从胰腺实质中适当释放尤为重要，其可与胶原酶协同产生有效的胰腺消化，显著提高胰岛产量和质量。中性蛋白酶（neutral protease，NP）可进一步增强细胞外基质中所有主要成分的降解，在酶降解中起着重要的作用，且其与热溶菌素（heat resistant lysol，TL）已广泛应用于临床胰岛分离。此外，来自多黏菌Paneibacillus polymyxa 的BP 蛋白酶（BPP）及来自C.histolyticum 的梭状芽孢杆菌的clostripain也已成功用于人类胰岛的分离。另有研究表明[18]，溶解液中钙离子的加入可促进胰腺消化，使胰岛从胰腺腺泡组织中分离和释放出来。但需要注意的是，消化过程中需要避免过度接触蛋白酶，防止胰岛分解破碎，降低胰岛产量[19，20]。将胰岛从胰腺腺泡组织释放出来取决于对胶原酶和NP 的最佳浓度的利用，然而批次间的差异、制造方法的差异以及缺乏共同的酶活性分析方法导致无法准确评估不同种类酶的疗效。

尽管许多改进胰岛细胞分离消化阶段的方法可以提高胰岛回收率，但它仍然很难预测胰岛纯化后的结果。在大多数情况下，胰岛在纯化过程中丢失，导致获得纯化胰岛量下降，因此优化胰岛纯化过程同样至关重要。胰岛纯化最常用的方法是使用COBE 2991 细胞处理器的密度梯度离心法，该方法可以从胰腺外分泌组织中分离出不同纯度的胰岛[21]。聚蔗糖（Ficoll）溶液是胰岛纯化最常用的溶液，约1.077 g/ml Ficoll 通常用于低密度溶液，约1.100 g/ml Ficoll 用于高密度溶液。密度梯度离心在胰岛纯化回收方面的各种改进源于梯度介质、纯化过程中的冷却系统、纯化前胰腺消化液的保存的发展。Noguchi H 等[22]通过改变碘二醇与纯化液的体积比，控制密度梯度纯化后胰岛产量和纯化后回收率均显著高于标准连续梯度法。Robertson GS 等[23]研究表明，UW 溶液可以有效降低外分泌组织水肿，提高胰岛纯化率。与此同时，Masayuki S 等[24]设计的大瓶离心法，其在不使用COBE 2991 细胞处理器的情况下，用2 个500 ml 塑料容器制造密度梯度离心体系，纯化所得高纯度胰岛较传统COBE 组产量高。另外，由于供体胰腺个体差异，并非所有胰岛均能被纯化获取，当纯化袋中仍能发现大量未纯化的胰岛时，Zorzi D 等[25]通过重新收集、离心、洗涤、Ficoll 重悬等再次纯化的方法对低纯度胰岛进行“补救”，可提高总胰岛产量和胰腺利用率，且胰岛功能评估结果与COBE 法纯化所得胰岛无明显差异。此外，密度梯度离心法在胰岛纯化回收方面的各种改进还包括纯化过程中的冷却系统、纯化前胰腺消化液的保存等，然而这些改进还没有实现普遍一致性，因而尚未推广应用。Mettler E 等[26]使用磁性分离胰岛，该方法虽然可以分离猪胰岛，且具有临床应用潜力，但该项技术如何转化到临床应用至今尚未明确。

3 胰岛培养对胰岛移植结果的影响

对于新鲜分离胰岛和培养后胰岛的效果尚存在争论。有研究表明[27]，新鲜分离的胰岛比培养至少24 h 的胰岛更好，其较培养第1、2、3 天的胰岛数分别下降13%、24%、35%。Noguchi H 等[28]研究表明，在移植到糖尿病裸鼠中，与培养胰岛相比，新鲜胰岛的降糖能力明显提高。由于培养过程或培养中的外分泌组织污染，使培养胰岛可引起炎症介质的过度表达[29]。此外，在培养过程中，胰岛只能通过扩散获得氧气，大胰岛核心更容易缺氧，进而引起氧化应激和凋亡诱导的基因上调[30]。研究表明[31，32]，培养后胰岛直径比新鲜胰岛直径要小，这表明培养过程中胰岛产量降低的主要原因是胰岛直径的减小。因此，在培养过程中，濒死的腺泡细胞释放的有害酶可能对胰岛细胞的生存有害。也有研究认为[33]，延长培养时间可以让胰岛从分离过程的压力中恢复过来，但仍需进一步研究验证。同时，胰岛培养可以为临床胰岛移植提供诸多好处，包括胰岛进行后续质量控制检测、等待距离较远患者到移植中心接受治疗、确定患者并进行免疫诱导等。目前，国际胰岛移植联盟（CIT）仍将移植前培养作为临床移植的标准程序。

研究表明[34]，在培养的24 h 内15%～20%的胰岛消失。较长的冷缺血时间、较低的胰岛纯度、大胰岛比例高均增加了胰岛丢失的风险。既往有研究[35，36]比较了22 ℃～26 ℃和37 ℃环境培养效果，结果发现与37 ℃培养相比，22 ℃～26 ℃培养可以增加猪的胰岛存活和DNA 复苏，且在22 ℃～26 ℃的培养环境中可以预防胰岛中央坏死。以上研究表明，22 ℃～26 ℃培养的胰岛可能优于37 ℃培养。

培养过程中胰岛质量和数量减少的机制之一是细胞凋亡[37]。研究表明[38]，经过消化和纯化后的胰岛缺乏周围基底膜，这种缺失导致固缩核和凋亡小体的增加，并伴随着促凋亡的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）亚型p38和c-Jun 氨基端激酶（c-jin N-terminal kinase，JNK）活性升高。此外，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）等细胞因子的刺激也可导致胰岛分离后的JNK 和p38 活性升高[39]。有报道称[40]，抑制p38 的激活可以降低这些促凋亡活性。以上研究提示，在胰岛培养的过程中，应用抑制JNK 和p38激活的抗凋亡药物可有效防止胰岛质量和数量的下降。

4 总结

胰岛移植具有移植手术简单、创伤小、治疗效果好等优势，已成为一种治疗1 型糖尿病的有效方法。胰岛移植成功与否取决于输注胰岛的质量和数量。尽管到目前为止人类胰岛分离和纯化方法已经较之前有重大进展，但由于供体胰腺本身存在个体差异，从单个胰腺中获取足够移植数量的胰岛仍然困难。目前的研究仍需致力于通过细化供体筛选、优化胰岛制备过程及移植前培养方面的提高获取更高质量和数量的胰岛，使其在受体内长期维持调控血糖的功能，从而保证胰岛移植长期疗效，为广大糖尿病患者带来福音，对推动糖尿病研究进展具有十分重要的意义。