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自然杀伤细胞（natural killer cells，NK）是指一类无需预先致敏就可以杀伤某些血液系统肿瘤和变异转化细胞的细胞类群。NK细胞是机体先天获得性免疫系统重要的组成细胞之一，因其杀伤靶细胞无需致敏，可以在免疫应答早期发挥作用；同时NK细胞免疫应答的早期还能释放多种趋化因子和细胞因子，调节机体的特异性免疫应答。因此NK细胞对肿瘤的治疗比较理想，但是人体内NK细胞的数量很少，只占外周血的5﹪～ 10﹪，需要体外扩增到一定的数量后，才能进行治疗。本实验的目的是建立一种简单、高效获得NK细胞的方法。

材料和方法

一、材料

RPMI 1640（美国 GIBCO 公司），淋巴细胞分离液（上海荣盛生物试剂厂），双抗：100万U/ml青霉素和 100 μg/ml链霉素（华北制药厂），rIL-2 10万U/ml（昆明总医院制剂室生产），苯丙氨酸甲酯（L-Phenylalanine methylamine ester，PME，美国Sigma公司）。

二、方法

（一）单个核细胞的分离

取健康人外周血10 ml，枸橼酸盐抗凝。无菌室内，转入 50 ml离心管中，加入 40 ml生理盐水，混匀，2000 ×g离心 3 min 除去上清，加入生理盐水至50 ml，重悬。将细胞悬液平均分配至两支加有20 ml淋巴细胞分离液的离心管中，2000 ×g离心 20 min。吸取以单个核细胞为主的白色云雾层至另一离心管中，加入适量的生理盐水，2000 ×g离心 3 min 除去淋巴细胞分离液。

（二）NK细胞的分离方法和培养扩增

1.NK细胞的分离方法：采用PME法。因PME可进入细胞内，代谢生成苯丙氨酸进入溶酶体内，降低溶酶体内渗透压，使溶酶体破裂，释放出酶使细胞溶解，从而有效去除富含溶酶体的单个核巨噬细胞、B细胞等，但同时不改变淋巴细胞的表型和细胞毒性。……