袁 园，蒋春跃，潘浩宇

酪氨酸高压在线三维荧光光谱研究

*袁 园，蒋春跃，潘浩宇

(浙江工业大学化学工程与材料学院，浙江，杭州 310014)

在Cu2+与酪氨酸摩尔浓度比为0至40范围内，用F-2500荧光仪分别对0.1 MPa和60 MPa条件下酪氨酸三维荧光进行了测量，并提取了三维荧光光谱数据中的平均值、标准差和重心等特征参数进行分析。实验结果表明，平均值与标准差随着压力的增加而增加，当压力由0.1 MPa增加到60 MPa时，平均值增加了8.8%。Cu2+对酪氨酸具有猝灭作用，但压力的增加使得Cu2+对酪氨酸荧光的猝灭作用减弱，当Cu2+与酪氨酸的浓度比由0增加到40，压力为0.1 MPa时，平均值和标准差均降低72.0%；但当压力增加到60 MPa时，平均值和标准差均降低64.4%。这种现象表明，压力的增加可以弱化Cu2+对酪氨酸的猝灭，这种作用随压力的增加而增大。

酪氨酸；高压；铜离子；三维荧光光谱

氨基酸是海洋溶解有机物的重要组成部分，虽然它们在海洋中的含量较低，但在海洋的各种物理与生物化学反应中却起着十分重要的作用，研究海洋中的氨基酸，对进一步揭示海洋溶解有机碳的来源、转化、循环以及生物可利用性具有重要意义。常见的具有荧光性质的氨基酸有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及苯丙氨酸(Phe)[1]。在深海环境中，诸多金属离子、静水压力及pH等因素与表层海洋环境明显不同，因此外界条件对氨基酸荧光性质的影响成为海洋学科的重要研究内容之一。三维荧光光谱（3DEEM）是最近几十年中发展起来的一种新的荧光分析技术，这种技术区别于普通的荧光分析的主要特点在于它反映了荧光强度随发射波长和激发波长同时变化的情况，能较完整地展示光谱信息，具有灵敏度高（10-9）、选择性高、用量少（1-2 mL）、信息量高以及方便快捷等优点广泛应用于海洋溶解有机物的研究[2-4]。

目前，前人的研究结果主要有：Ruan等[5]研究了pH 为7.3下，常压至650 MPa范围内压力对色氨基酸、色氨酸衍生物荧光光谱的影响，结果表明，压力对色氨酸水溶液荧光强度具有增敏作用。Tabak等[6-7]研究了Cu2+、Ni2+与色氨酸的相互作用，结果表明Cu2+、Ni2+对色氨酸的荧光具有猝灭作用。陶丽梅[8]等人研究了生命必需元素对色氨酸荧光效应的影响，发现Cu2+、 Fe3+、Mo5+等金属离子对色氨酸的荧光有猝灭作用，而Zn2+、Cr3+、Mn2+、Co3+、Ca3+、Na+等金属离子对色氨酸的荧光几乎没有猝灭作用。向润青[9]等利用二维荧光光谱研究了压力对酪氨酸荧光的影响，发现酪氨酸荧光强度随着压力的增加而增加。

以上研究结果表明，利用三维荧光光谱法研究不同浓度金属离子及静水压力对氨基酸荧光光谱特性的影响报道较少。因此，本文结合三维荧光光谱法研究了不同Cu2+浓度与静水压力共同作用对酪氨酸荧光光谱特性的影响，并结合特征参量化方法提取了三维荧光数据中的平均值、标准差和重心进行结果分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器： F-2500型荧光光谱仪（日本日立公司），高压在线检测装置由浙江大学提供[10]。

储备液和工作液的配置：酪氨酸（Tyr, 生化试剂, 德国Sigma-Aldrich产）和氯化铜（CuCl2, 分析纯, 上海振欣试剂厂）分别配制成1×10-3mol/L和2×10-3mol/L储备液, 常温避光保存；用三羟甲基氨基甲烷（Tris, 分析纯, 国药集团化学有限公司）和浓盐酸（HCl, 分析纯, 衢州巨化试剂有限公司）配制pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液；其他试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。取少许酪氨酸和氯化铜储备液，以pH7.4的Tris-HCl缓沖液配制Cu2+离子和酪氨酸浓度比为0, 2, 5, 10, 20, 40的梯度液，其中酪氨酸浓度1×10-4mol/L。

1.2 实验方法

设置荧光扫描速度为3 000nm/min、PMT电压400 V，激发波长设定为230~320 nm，间隔5 nm，发射波长设定为220 ~600 nm，间隔1 nm，酪氨酸样品在常压和高压比色皿中进行检测。

1.3 特征参量的提取

三维荧光光谱，难以直接对酪氨酸的荧光性质进行描述。三维荧光光谱的特征参量化方法是应用数学统计理论[11]从三维荧光光谱信息中提取出最相关的信息，将三维荧光光谱看做一个二维区域上能量的连续分布，达到减小信息冗余的目的。胡泽建[12]首次提出提取三维荧光光谱的平均值、标准差、中心距等特征值，并将其应用于油种鉴别领域, 为油种鉴别、分类提供可靠依据。本文以提取三维谱图的平均值、标准差和重心数据对实验结果进行分析。

1）平均值：

其中z表示在(，)处的荧光强度，和是以纳米为单位的波长值，是表示离散点的总数。平均值可以代表三维荧光谱的平均能量强度，用于三维荧光光谱的无因次化。

2）标准差：

标准差代表荧光强度的离散程度。

3）重心：

重心为其二维分布的质量中心，是反映三维荧光光谱平面分布的重要参数。

2 结果与讨论

2.1 酪氨酸三维荧光谱图分析

对所配置好的酪氨酸样品在压力为0.1 MPa、60 MPa，Cu2+浓度与酪氨酸浓度比（[Cu2+]/[Tyr]）分别为0、2、5、10、20、40时进行荧光扫描，得到三维荧光光谱。图1为压力为0.1 MPa时纯酪氨酸的三维荧光光谱，从图中可以看出，酪氨酸主要存在三个峰，即一个散射峰和两个特征峰。在激发波长230 nm有一个强度稍低但明显的光谱波峰，为第一特征峰；在激发波长为275 nm左右有一个荧光强度最大荧光峰，为第二特征峰。

图1 压力为0.1 MPa时纯酪氨酸的三维荧光光谱（[Tyr]=10-4mol·L-1,pH=7.4）

2.2 三维谱图特征参量分析

观察实验获得的大量三维荧光光谱图发现，难以直接对酪氨酸荧光光谱进行描述。本文以数理统计为基础，提取了荧光强度的平均值、标准差和重心数据，如表1所示。

表1 酪氨酸和Cu2+的混合溶液在0.1 MPa和60 MPa的特征参量对比数据

从表1数据可以看出:平均值随着压力的增加而增加，当压力由0.1 MPa增加到60 MPa时，纯酪氨酸荧光强度的平均值增加了8.8%。结合文献[12]可知：常压下酪氨酸存在着如式（4）的电离平衡体系。pH为7.4时，酪氨酸主要以NH3+-Tyr-COO-（H2L）和NH2-Tyr-COO-（HL-）形式存在。本文测定了常压下，pH值分别为3、6.0、7.4、9.0的酪氨酸水溶液荧光强度，如图2所示。从图2可知，当pH值为6.0时，荧光强度最大，表明四种离子态中H2L荧光强度最强，而HL-的荧光强度要小于H2L，压力的增加使得酪氨酸的离子形态由HL-向H2L转变，从而使得酪氨酸的荧光强度增强。重心能够反映出物质的激发-发射谱中荧光强度集中的波长位置，从重心数据可以看出，压力未对酪氨酸的光谱荧光强度集中位置产生影响。

图2 不同pH值下酪氨酸荧光强度([Tyr]= 10-4 mol·L-1)

从表1中还可以看出，Cu2+对酪氨酸的荧光具有猝灭作用。常压条件下，当Cu2+与酪氨酸的浓度比由0增加到40，平均值和标准差均降低了72.0%；但当压力为60 MPa的时候，平均值和标准差均降低了64.4%。说明压力的增加使得Cu2+的猝灭作用减弱。这可以从Cu2+对酪氨酸的猝灭常数变化得到说明。

从三维谱图中提取二维数据可得0.1 MPa和60 MPa下，Cu2+和酪氨酸混合溶液三维荧光光谱的第二特征峰的峰值，见表2。

表2 Cu2+-酪氨酸在0.1MPa和60MPa下的三维荧光光谱第二特征峰峰值

荧光猝灭分为静态猝灭和动态猝灭。结合文献可知[13-14]：Cu2+对酪氨酸荧光的猝灭属于静态猝灭，根据静态猝灭与结合点的相关理论，则有

其中B是荧光分子，Q是猝灭分子，BQn是猝灭的荧光分子，那么该反应的形成常数为：

若荧光分子的总浓度为[B0]，则[B0]=[Bn]+ [B]，[B]是未反应的荧光分子的浓度。则有：[B]/[B0]=F/F0，其中和F分别为荧光分子在猝灭分子存在和不存在时的荧光强度，则：

式中，K是猝灭分子与荧光分子的结合常数，为结合点数，根据表2中的数据将log[(F-)/]对log[]作图，可获得结合位点数和结合常数K，如表3所示，从表3可知，60 MPa时的K小于0.1 MPa时的值，说明压力增加有利于络合分子的解离，从而导致Cu2+对酪氨酸的猝灭作用减弱。

表3 Cu2+-酪氨酸络合物于不同pH条件下的结合常数Ka和结合位点数n

3 结论

本文对0.1 MPa和60 MPa下不同浓度Cu2+存在下的酪氨酸三维荧光光谱进行了测量，并结合特征参数化理论提取了三维数据中的平均值、标准差和重心数据进行结果分析。结果表明：酪氨酸的荧光强度随着压力的增强而增加；Cu2+对酪氨酸的荧光具有明显猝灭作用，这种作用随Cu2+浓度增大而增大；压力的增加弱化了Cu2+对酪氨酸的猝灭作用。这些理论成果为将酪氨酸作为外源引入或内源性荧光探针在探索蛋白质的构象变化及环境监测、海洋氮循环等方面提供了一定的参考价值。

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THE STUDY OF TRYPTOPHAN ON-LINE THREE-DIMENSIONAL FLUORESCENCE SPECTRA

*YUAN Yuan, JIANG Chun-yue, PAN Hao-yu

(College of Chemical Engineering and Materials Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou, zhe jiang 310014,China)

The three-dimensional fluorescence spectra of tyrosine solution with different concentrations of copper ion under 0.1 MPa and 60 MPa were detected through F-2500 made in Japan. And the characteristic parameters of mean, deviation and barycenter were extracted based on the principle of mathematical statistics. The results showed that the parameter of mean increased with the increase of pressure, and the parameter of mean increased by 8.8% when the pressure changed from 0.1 MPa to 60 MPa. The fluorescence of Tyr aqueous solution was quenched obviously due to complex formation with Cu2+. The quenching weakened when the pressure increased. The parameters of mean and deviation decreased by 72.0% under 0.1MPa when the concentration ratio of Cu2+and tyrosine changed from 0 to 40, while only 64.4% under 60 MPa. This phenomenon shows that pressure can reduce the quenching, and the effect become obvious with increase of pressure.

tyrosine; high pressure; copper ion; three- dimensional fluorescence spectra

O657.31

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2012.04.016

1674-8085(2012)04-0070-04

2012-03-28；

2012-05-11

国家自然科学基金项目(40676059）

*袁 园(1988-)，女，江西宜春人，硕士生，主要从事化工与材料科学研究(E-mail: yuanyuan2989@126.com);

蒋春跃(1958-)，男，浙江诸暨人，教授，博士，主要从事绿色化工与材料科学，生化反应工程，极端环境下的过程技术及应用研究(E-mail: zjjcy@zjut.edu.cn);

潘浩宇(1987-)，男，浙江金华人，硕士生，主要从事极端环境下的过程技术及应用研究(Email: yulu321@126.com).