熊升林 刘行 莫中成 易光辉

心肌肥厚是心肌细胞对各种心血管疾病所导致的血流动力学超负荷的一种适应性反应，一定程度的心肌肥厚具有代偿意义，但过度的心肌肥厚则是导致心力衰竭、心律失常和猝死的重要的细胞病理学基础。他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂，是胆固醇合成抑制剂，它的生物学作用包括:改善内皮功能［1］，增加一氧化氮活性［2］，抑制炎症因子表达［3］，稳定斑块［4］等，同时具有独立于调脂之外的心血管保护作用，能够抑制血管平滑肌细胞增殖，逆转左室肥厚［5］。

1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)是磷脂代谢的脂质介质，研究表明S1P既可以作为胞内第二信使，又可以作为细胞间信号分子，通过与细胞表面受体(S1P receptor，S1PR)结合而发挥广泛的生物学效应［6］。在S1P对心肌肥厚作用的研究上发现，S1P呈浓度依赖性诱导心肌细胞内心肌蛋白合成增加，心肌细胞形态增大，最终造成心肌肥厚［7］。本课题组研究显示S1P2受体途径介导S1P所诱导的心肌细胞肥厚，这一途径与蛋白激酶C(protein knase C，PKC)信号通路相关［8］，可见 S1P在肥厚心肌发生中起着相当重要的作用。阿托伐他汀可显著提高牛主动脉内皮细胞的S1P1受体表达水平［9］，同时可增加糖尿病大鼠心肌细胞中血管紧张素转换酶 2(angiotensin I converting enzyme，ACE2)的表达，减少心肌纤维化，抑制心肌肥厚［10］。本实验观察阿托伐他汀对S1P诱导乳鼠心肌细胞肥大中的作用，从而为阿托伐他汀抑制心肌肥厚的研究提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1～3 d龄SD大鼠(南华大学医学院实验动物学部提供)。试剂:S1P(Cayman);阿托伐他汀(大连辉瑞公司);TRIzol试剂、5'2溴脱氧尿苷(Br2du)、胰蛋白酶(Sigma);DMEM培养液、新生牛血清、Ⅰ型胶原酶(Gibco);羊抗大鼠β-Actin单克隆一抗、兔抗大鼠β-MHC IgG(Cell singal);相应二抗、ECL增强型化学发光显色试剂(南京碧云天生物技术有限公司);总 RNA反转录试剂盒(Fermantas)，qPCR 试剂盒(Invitrogen);［3H］-亮氨酸(Leu)(上海华壹公司)。

1.2 乳鼠心肌细胞培养和心肌细胞肥大模型的建立

心肌细胞培养方法和模型建立参照［8］。根据前期实验，选择以S1P 1 μmol/L作为实验处理浓度，心肌细胞肥大指标包括心肌细胞体积和蛋白质合成速率，分别以细胞图像分析系统和［3H］-亮氨酸掺入法测量。

1.3 心肌细胞［3H］-亮氨酸掺入量测定

心肌细胞蛋白质合成速率用［3H］-亮氨酸掺入量来测定。按上述分组加入不同干预药物时，加入［3H］-亮氨酸3.7 ×108mBq/孔，培养 48 h 后，将细胞收集于玻璃纤维素膜上，然后用10%三氯乙酸和无水乙醇再冲洗。滤膜烘干后置于含5 ml闪烁液的闪烁瓶中，以LS8100型液体闪烁仪(Beckman)测定放射性强度(cpm/cell)。

1.4 心肌细胞β-MHC和心房利钠肽的mRNA水平测定

各实验组心肌细胞中β-MHC基因的表达情况通过实时定量PCR的方法检测。先提取细胞总RNA，用2 μl总RNA反转录成 cDNA，再取反转录产物2.0 μl进行PCR循环。依据文献检索及在Entrez PubMed上验证，设计出相应的引物，β-MHC上游引物:5'-TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA ATT GCT-3''，下游引物:5'-AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT-3';心房利钠肽(atrial natriuretic factor，ANF)上游引物:5'-CAA TCA CTC AGT CAG TGT GA-3'，下游引物:5'-CCT ATT GCT TCG TCA GAA TC-3';内参 β-actin的上游引物:5'-GTAAA GACCT CTATGC CAACA-3'，下游引物:5'-GGACT CATCG TACTCC TGCT-3'。qPCR扩增条件:预变性:95℃ 5 min;变性:95℃ 10 s;退火:61℃ 30 s;72℃ 30 s延伸，40次循环。反应结束后，确认qPCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR相对定量分析。

1.5 心肌细胞β-MHC蛋白水平测定

β-MHC蛋白水平采取Western blot法测定。处理好的6孔板的细胞PBS清洗裂解提取总蛋白，用Bradford方法测定蛋白浓度。提取的蛋白用10%SDS-PAGE电泳后，将其转移至PVDF膜上(100 mA 2 h)，蛋白质转移情况应用丽春红染色观察。常温下5%脱脂牛奶封闭2 h，分别加入兔抗大鼠β-MHC(1∶400)，羊抗大鼠 β-Actin 单克隆一抗(1∶1000)，4℃孵育过夜，TBST溶液洗膜3次×15 min。于室温加相应二抗(1∶5000)于摇床上于杂交膜孵育2 h，弃除液体，以TBST漂洗硝酸纤维素膜3次×15 min，与ECL试剂反应1 min，X线片曝光显影，凝胶成像分析系统摄像分析。实验组β-MHC的面积灰度值减去背景灰度值与经过同样处理的β-actin灰度值的比值进行比较，以对照组比值为100%与实验组进行比较和半定量分析。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 阿托伐他汀对肥大心肌细胞的蛋白质合成速率的影响

在本课题组前期试验中，S1P诱导乳鼠心肌细胞体积增大，蛋白合成量增多，尤以S1P 1 μmol/L最明显，从而以1 μmol/L作为S1P的标准实验浓度处理心肌细胞48 h，建立乳鼠心肌细胞肥大模型［8］。经阿托伐他汀处理组 24 h，再用 S1P(1 μmol/L)处理心肌细胞48 h，结果显示:阿托伐他汀10μmol/L处理组比S1P组［3H］-亮氨酸掺入率减少 ［(234.89% ±31.23%)比(342.23% ±31.60%)，P=0.205］，而阿托伐他汀 20 μmol/L 处理组［3H］-亮氨酸掺入率明显减少［(189.07% ±17.69%)比(342.23% ±31.60%)，P ＜0.01］。

2.2 阿托伐他汀对S1P诱导的肥大心肌细胞β-MHC的mRNA和蛋白质表达影响

与对照组比较，S1P组的β-MHC mRNA和蛋白水平增加(P＜0.05);阿托伐他汀10 μmol/L处理组较S1P组β-MHC mRNA和蛋白水平下降(P＜0.05)，而阿托伐他汀 20 μmol/L处理组 β-MHC mRNA和蛋白水平则显著下降(P＜0.01)(表1)。

表1 不同浓度的阿托伐他汀对S1P诱导的肥大心肌细胞β-MHC表达的影响(，n=12)

表1 不同浓度的阿托伐他汀对S1P诱导的肥大心肌细胞β-MHC表达的影响(，n=12)

注:与对照组比较，aP＜0.05;与 1 μmol/L S1P组比较，aP＜0.05，bP ＜0.01

0.68±0.15 0.47±0.081 μmol/L S1P组 0.84±0.20a 0.98±0.15a 1 μmol/L S1P 组 +阿托伐他汀(10 μmol/L)-actin对照组分组 mRNAβ-MHC/β-actin蛋白β-MHC/β 0.59±0.14a 0.55±0.09a 1 μmol/L S1P 组 +阿托伐他汀(20 μmol/L)0.50±0.12b 0.35±0.08b

2.3 阿托伐他汀对S1P诱导的肥大心肌细胞ANF的mRNA表达变化

与对照组比较，S1P组的 ANF mRNA增加［(0.45±0.12)比(0.76 ±0.19)，P=0.325)］;阿托伐他汀10 μmol/L处理组，较S1P组ANF mRNA下降［(0.51±0.13)比(0.76±0.19)，P=0.445］，阿托伐他汀20 μmol/L处理组ANF mRNA水平则显著下降［(0.47±0.12)比(0.76±0.19)，P＜0.01］。

3 讨论

心肌肥厚是心脏为适应各种刺激而产生的心肌细胞体积增大，重量增加。机械张力可刺激心肌组织自身合成和表达产生各种内分泌因子:肾素-血管紧张素系统成分，儿茶酚胺类，胰岛素样生长因子，一氧化氮合成系统等［11］。细胞因子可通过化学信号与各自的受体结合并激活相应的蛋白激酶如蛋白激酶 C［12］、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)［13］、钙 调 蛋 白 (calmodulindependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)［14］，激活的蛋白激酶通过多种细胞内信号转导通路使某些转录因子磷酸化或细胞内钙离子增高，钙调蛋白依赖的磷蛋白磷酸化或脱磷酸的转录因子移位入细胞核，激活即刻早期反应基因，如原癌基因(c-fos、c-myc)及热休克基因，它们再通过表达转录调节因子、生长因子及信号转导途径的蛋白质而调控下游基因表达［11，15］。上述信号途径可使心肌细胞基因向“胚胎型”表型转化，如 β-MHC改建、肌浆网 ATP酶的RNA转录水平下降［16］。β-MHC突变被认为是最具有代表性的，心肌肥厚中α-肌球蛋白向β-MHC的转变是心肌肥厚的重要标志。

阿托伐他汀钙是新一代他汀类降血脂药。血脂异常患者使用他汀类药物的研究表明，血液中低密度脂蛋白达标率在阿托伐他汀钙组为18.0%，而在辛伐他汀组为7.8%。阿托伐他汀还可增加糖尿病大鼠心肌细胞中ACE2的表达，减少心肌纤维化，抑制心肌肥厚［17］。

在压力超负荷性心肌肥厚中，S1P和心肌肥厚有密切关系，其在参与心肌细胞对压力超负荷的应答方面起重要作用。S1P作为细胞外信号配基与G蛋白偶联受体结合S1P1激活MAPK，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)细胞内信号途径，诱导心肌肥厚。研究显示特异性MAPK抑制剂可抑制AngⅡ所引起的ANF mRNA和蛋白表达的增加，减轻心肌肥厚症状，提示AngⅡ引起的心肌肥厚有MAPK信号通路的参与［12-13］。心脏的结构基因β-MHC、骨骼肌肌动蛋白、ANP等表达增强，致使心肌细胞体积增大，蛋白合成增加及心肌细胞的表型改变。从前期实验结果中，我们发现与空白对照组比较，S1P组的β-MHC蛋白和mRNA水平显著增加，提示S1P可刺激β-MHC蛋白表达增强，而β-MHC基因在心肌肥厚发生发展过程起着重要作用。本实验结果显示阿托伐他汀(20 μmol/L)预处理组［3H］-亮氨酸掺入率较S1P组显著减少，表明阿托伐他汀可抑制S1P诱导乳鼠心肌细胞的蛋白合成。阿托伐他汀(10 μmol/L)预处理组的β-MHC蛋白和mRNA表达水平较S1P组下降，且阿托伐他汀(20 μmol/L)预处理组下降显著，表明S1P诱导β-MHC表达增加并导致心肌肥厚的作用可被阿托伐他汀所减弱，从而抑制心肌细胞β-MHC基因的表达。进一步实验显示，S1P可诱导心肌细胞ANF的表达水平增加，而阿托伐他汀能下调S1P所诱导的心肌细胞ANF的表达。实验结果表明，阿托伐他汀能下调S1P诱导的β-MHC和ANF的表达，其机制尚需进一步研究。阿托伐他汀可抑制S1P介导的心肌肥大作用可能是他汀类药物的新机制，从而为阿托伐他汀预防和治疗心肌肥厚及对心血管的保护作用提供新的实验依据。

［1］Schachinger V，Britten MB，Zeiher AM.Prognostic impact of coronary vasodilator dysfunction on adverse long-term outcome of coronary heart disease.Circulation，2000，101:1899-1906.

［2］Gokce N，Keaney JJ，Hunter LM，et al.Risk stratification for postoperative cardiovascular events via noninvasive assessment of endothelial function:a prospective study.Circulation，2002，105:1567-1572.

［3］Ridker PM，RifaiN， PfefferMA， etal. Inflammation，pravastatin，and the risk of coronary events after myocardial infarction in patients with average cholesterol levels.Cholesterol and Recurrent Events(CARE)Investigators.Circulation，1998，98:839-844.

［4］Bellosta S，Via D，Canavesi M，et al.HMG-CoA reductase inhibitors reduce MMP-9 secretion by macrophages.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1998，18:1671-1678.

［5］Pan XD，Zeng ZH，Liang LY，et al.The effects of simvastatin on left ventricular hypertrophy and left ventricular function in patients with essential hypertension.Clin Exp Hypertens，2011，33:558-564.

［6］Xiong SL，Zhang QH，Liu X，Yi GH.The cardiovascular protective effects and signaling mechanism of sphingosine-1-phosphate.Chin J Cardiovasc Med，2011，16:146-148.熊升林，张清海，刘行，等.高密度脂蛋白相关1磷酸鞘氨醇对心血管的保护作用及其信号机制.中国心血管杂志，2011，16:146-148.

［7］Robert P，Tsui P，Laville MP，et al.EDG1 receptor stimulation leads to cardiac hypertrophy in rat neonatal myocytes.J Mol Cell Cardiol，2001，33:1589-1606.

［8］Li YY，Xiong SL.Sphingosine-1-phosphate-protein kinase C signaling regulates the cardiomyocyte hypertrophic responses induced by sphingosine-1-phosphate.Chin J Arteriosclerosis.2011，7:573-577.李跃艳，熊升林.1-磷酸鞘氨醇受体途径诱导的心肌肥大及蛋白激酶C的调节作用.中国动脉硬化杂志，2011，7:573-577.

［9］Igarashi J，Miyoshi M，Hashimoto T，et al.Statins induce S1P1 receptors and enhance endothelial nitric oxide production in response to high-density lipoproteins.Br J Pharmacol，2007，150:470-479.

［10］Aguilar C，Ventura F，Rodriguez-Delfin L.Atorvastatin induced increase in homologous angiotensin I converting enzyme(ACE2)mRNA is associated to decreased fibrosis and decreased left ventricular hypertrophy in a rat model of diabetic cardiomyopathy.Rev Peru Med Exp Salud Publica，2011，28:264-272.

［11］Dai WJ，Wang YG.Progress in molecular mechanisms of cardiac hypertrophy.Advances in Cardiovascular Diseases，2009，30:47-50.戴文建，王以光.心肌肥厚分子机制研究进展.心血管病学进展，2009，30:47-50.

［12］Ruf S，Piper M，Schluter KD.Specific role for the extracellular signal-regulated kinase pathway in angiotensin II-butnot phenylephrine-induced cardiac hypertrophy in vitro.Pflugers Arch，2002，443:483-490.

［13］Aoki H，Richmond M，Izumo S，et al.Specific role of the extracellular signal-regulated kinase pathway in angiotensin II-induced cardiac hypertrophy in vitro.Biochem J，2000，347:275-284.

［14］Maier LS.Ca(2+)/Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ(CaMKⅡ)in the heart.Adv Exp Med Biol，2012，740:685-702.

［15］Fu DY，Wang SH，Zhou D，et al.Effects of Huoxue Qianyang Formula on expressions of proto-oncogenes c-fos and c-myc in spontaneous hypertensive ratswith ventricularhypertrophy.Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao，2008，6:387-391.

［16］Di Domenico M，Casadonte R，Ricci P，et al.Cardiac and skeletal muscle expression of mutant beta-myosin heavy chains，degree of functional impairment and phenotypic heterogeneity in hypertrophic cardiomyopathy.J Cell Physiol，2012，227:3471-3476.

［17］Bozentowicz-Wikarek M，Kocelak P， Smertka M， etal.Effectiveness of lipid-lowering therapy with statins for secondary prevention of atherosclerosis-guidelines vs.reality.Pharmacol Rep，2012，64:377-385.