刘丹娟，李莉艳，李 强，孙 竞，钟 梅，罗深秋△

（南方医科大学：1.细胞生物学教研室／骨与软骨再生重点实验室；2.南方医院妇产科；3.南方医院检验科；4.南方医院血液科，广州 510515）

血友病是一组X连锁隐性遗传的出血性疾病，临床上常见的有A型血友病（HA）和B型血友病（HB）两型，分别是由于凝血因子（F）Ⅷ和FⅨ基因突变所引起。在男性血友病患者中，HA占80%～85%，而HB仅占15%～20%，在男性中的发病率大约为1／30 000［1］，女性患者罕见。HB基因突变具有明显的异质性，可发生在FⅨ基因外显子、内含子、启动子及其侧翼序列的任何位置［2］。目前已知的FⅨ基因突变类型包括点突变、缺失、插入等。

本研究利用PCR法及DNA测序技术对31例HB患者进行FⅨ基因突变检测，对于明确FⅨ基因突变机制有重要意义，且丰富了FⅨ基因突变谱。

1 资料与方法

1.1 一般资料 31例HB患者均来自本院血液科及妇产科门诊，FⅨ活性测定均小于5%。

1.2 研究方法 采集HB患者外周血2mL，以乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用外周血DNA提取试剂盒（美国Life公司）提取DNA。根据FⅨ基因序列（Gene Bank K02402），参照文献［3］设计并合成8对扩增引物（表1），引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

PCR反应总体积为50μL，加入上游和下游引物各5pmol（终浓度为0.1μmol／L），4种dNTP各5nmol（终浓度为0.1 mmol／L），5μL 10×Taq PCR Buffer（100mmol／L Tris－HCl，15mmol／L MgCl2和 500mmol／L KCl，pH 8.3），2U Taq DNA聚合酶（TAKARA公司），基因组DNA 50～200ng。PCR反应在美国PE公司的9700型热循环仪上进行。测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成。

表1 引物序列

续表1 引物序列

2 结 果

31例HB患者通过DNA测序均检测到了突变位点。检测结果显示，FⅨ基因的突变位点分散无热点区，突变类型也不同。本研究中共发现了34种突变，其中1例为三重突变，6例为双重突变，此外还发现13种新突变。……