陈文强，陈 萍，庞丽红，李树全，林伟雄，杨德寨

（1.广西医科大学医学科学实验中心，南宁530021；2.广西医科大学第一附属医院产前诊断中心，南宁530021）

地中海贫血（以下简称地贫）是一种常染色体遗传慢性溶血性疾病，该病多见于我国广东，广西等地区。根据基因突变的不同，主要分为α地贫和β地贫两大类。Hb Westmead突变属于非缺失型地贫中的一种，可产生轻度不稳定的血红蛋白变异体［1］。单纯的Hb Westmead突变携带者没有贫血的临床表现，但是与携带有轻型地贫患者婚育，则有可能生下中间型α地贫患儿。为了准确、简单、快速地诊断该病，本文应用Taqman－MGB探针技术，建立了Hb Westmead突变荧光探针检测方法，检测过程操作简单、快速，检验结果准确、特异性高。

1 资料与方法

1.1 一般资料 全部病例来自在广西医科大学第一附属医院门诊就诊的患者，选择平均红细胞体积在70～80fl之间的患者共200例，其中，男96例，女104例。

1.2 方法

1.2.1 血液学分析 用血细胞自动分析仪（ACT5DF，美国Beckman）进行检测，收集平均红细胞体积（MCV）等数据。

1.2.2 DNA提取 自动核酸提取仪（Lab－Aid 820，厦门百维信）提取DNA，微量紫外分光光度计（NanoDrop ND－8000，美国Thermo）检测DNA浓度。

1.2.3 引物设计与合成 设计正向扩增引物：W1：GCG CAG GAG GAA CGG CTA和反向扩增引物 W2：CGG CAC TGA CCC TCT TCT CT，扩增目标片段；合成两条MGB探针M1：FAM－CAG GGA GGC GTG CA，M2：VIC－CAG GGA GGC CTG CA；检测含α2珠蛋白基因CD122（CAC→CAG）突变，引物和探针由美国ABI公司合成。

1.2.4 实时定量PCR反应 PCR扩增体系总体积为25μL：其中 Master mix 12.5μL，20×Taqman genotype assay 1.25 μL，DNA模板1.0μL，加双蒸水至25μL。实时定量PCR扩增条件：95℃预变性10min→ （95℃10s，60℃60s）共40个循环；在实时荧光定量PCR仪（7500Fast，美国ABI）进行扩增反应。反应结束后对扩增曲线进行分析，判定结果。

1.2.5 DNA 测序 设计上游引物：L1：5′－CCT GGG CCG CAC TGA CCC TCT T－3′。下游引物 L2：5′－GTC TGA GAC AGG TAA ACA CCT CCA T－3，扩增含目标基因第122位密码子的α2珠蛋白基因片段，扩增产物长度为340bp。反应体系包括：10×Buffer 5μL，2.5mMol／L d NTPs 4μL，15 pmol／L引物1μL，1.0UTaq酶（大连宝生物），模板2.0μL，加双蒸水至50μL。反应条件：预变性94℃5min，变性94℃30s，退火、延伸64℃90s，共30个循环，72℃延伸10min。经纯化后使用BigDyeTM Terminator v3.1Ready Reaction Cycle Sequencing试剂盒在全自动测序仪（PRISM3730，美国ABI）上进行产物测序。

1.3 统计学处理 使用SPSS17.0软件，利用Kappa分析比较两种检测方法检测结果的一致性。

2 结 果

2.1 血常规情况 200例患者的RBC水平为（4.92±0.65）×1012／L，HB水平为（122.66±17.89）g／L，MCV 水平为（76.04±2.93）fl，MCH 水平为（24.91±1.42）pg。

2.2 Taqman－MGB探针法检测Hb Westmead突变结果 在检测200例患者中，发现Hb Westmead突变12例，其中，男5例，女7例，其余188例患者检测结果为正常。在健康人标本检测结果可见三条反应曲线，而Hb Westmead突变基因携带者标本的扩增曲线可见四条曲线，健康人和携带者扩增曲线的位置，形态有区别明显。

2.3 基因测序法检测Hb Westmead突变结果 基因测序法检测结果见图1，在200例患者中，其余188例患者检测结果为正常，结果见图1A，检测出Hb Westmead突变12例，其中，男5例，女7例，结果见图1B。

图1 地贫Hb Westmead突变DNA测序结果

2.4 统计学分析结果 经Kappa分析，Kappa＝1，P＜0.01，两种检测方法的检测结果一致，即对所研究对象同时用Taqman－MGB探针法和基因测序法检测Hb Westmead突变发生率，统计结果表明两种检测方法对Hb Westmead突变的检出率没有差别。

3 讨 论

Hb Westmead是一种非缺失型α地贫，是α2－珠蛋白基因CD122（CAC→CAG）突变所致的静止性血红蛋白变异体，具有轻度不稳定性。Hb Westmead突变基因携带者，临床上没有贫血、黄疸等表现，血常规检测可以是正常或只有轻微改变，如血色素、MCV、MCH等指标轻微降低，比较容易出现漏诊。Hb Westmead突变基因携带者可在感染、发热或使用磺胺等氧化性药物的情况下出现溶血，导致轻微的贫血［2］。本文中所发现的12例患者，均没有贫血表现，而是在例行婚前，孕期体检中发现MCV轻微降低，进一步做基因诊断而发现。

由于Hb Westmead是一种电泳静止型的血红蛋白变异体，因此各种酸性或碱性醋酸纤维膜电泳、垂直等电聚焦法均不能使之分离；高效液相色谱法进行血红蛋白分析时也没有特异性波峰出现。针对该异常血红蛋白的特异性检测方法是Fleming等使用的pH 6.4柱层析电泳法，他用这个方法从血红蛋白中分离并发现了Hb Westmead［1］，另外，对该血红蛋白的测定使用毛细管电泳法［3］，反相高效液相色谱法等方法［4］。对Hb Westmead的CD122（CAC→CAG）突变的基因诊断则使用PCR联合StuI内切酶法［5］，温度梯度凝胶电泳法［6］和反向斑点杂交等方法检测该突变点，但这些方法操作步骤多，检测周期长。本研究采用Taqman－MGB探针法直接探测PCR过程中荧光信号的变化，以获得定性的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，检测步骤简单，检测周期短，可在短时间内得出结果。本文200例标本用Taqman－MGB探针法检测，结果和基因测序的结果一致，说明该方法具有较高的可靠性。同时该方法所设计的MGB探针结合在DNA双螺旋内，使探针的结合稳定；其次MGB探针的较短，报告基团与淬灭分子在位置上很接近，这样使得实验的结果有较高的精确度；另外探针3C端结合了MGB，探针的Tm值提高，使突变与非突变模板间的Tm值差异增加，提高了检测的特异性。综上所述，Taqman－MGB探针法可以快速检测Hb Westmead突变，结果稳定可靠，特异性高。

Hb Westmead在澳大利亚［1］、巴西［7］、老挝［8］及国内香港地区［9］均有个例报道，但病例报道数量不多。在广西也有相关报道［10－11］，在本文中，检测的200红细胞体积轻微异常患者共发现12例Hb Westmead突变，发生率为6%，说明Hb Westmead突变在广西有着比较高的基因携带率。在这12例患者中，均无明显贫血症状，但当Hb Westmead复合东南亚α地贫时（HbH病；－－SEA／αWSα）可出现脾脏增大，轻度贫血等临床症状［12］。因此，在产前优生遗传咨询时，对于一方已诊断轻型或中间型α地贫，另一方没有贫血症状、但血常规有 MCV轻微降低的夫妇，注意需要进一步做Hb Westmead突变的基因分析，以免漏诊，生下 HbH 病（－－SEA／αWSα）的患儿。

［1］ F leming PJ，Hughes WG，Farmilo RK，et al.Hemoglobin Westmead alpha 2 122（H5）His replaced by Gln beta 2：a new hemoglobin variant with the substitution in the alpha 1beta 1contact area［J］.Hemoglobin，1980，4（1）：39－52.

［2］ L iang S，Tang Z，Su C，et al.Hb Duan［α75（EF4）Asp→Ala］，Hb Westmead［α122（H5）His→Gln］，andα－thalassemia－2（－4.2kb deletion）in a Chinese family［J］.Hemoglobin，1988，12（1）：13－21.

［3］ T ang HS，Zhou JY，Xie XM，et al.Screening for common nondeletionalα－thalassemias in Chinese newborns by determination of Hb Bart′s using the Sebia Capillarys 2electrophoresis system［J］.Hemoglobin，2012，36（2）：196－199.

［4］ W an JH，Tian PL，Luo WH，et al.Rapid determination of human globin chains using reversed－phase high－performance liquid chromatography［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2012，901：53－58.

［5］ Lin T，Shih H，Liu S，et al.Hb Westmead in a Taiwanese subject：detected by PCR and StuI restriction enzyme methods［J］.Int J Lab Hematol，30Suppl：124.

［6］ Li R，Liao C，Li DZ，et al.High－resolution melting analysis of the three common nondeletionalα－thalassemia mutations in the chinese population：Hbs constant spring，quong sze and westmead［J］.Hemoglobin，2010，34（6）：587－593.

［7］ Wenning MR，Kimura EM，Costa FF，et al.alpha－globin genes：thalassemic and structural alterations in a Brazilian population［J］.Braz J Med Biol Res，2000，33（9）：1041－1045.

［8］ Gu YC，Gu LH，Wilson JB，et al.Hb Westmead［alpha 122（H5）His→Gln］，Hb E ［beta 26（B8）Glu→Lys］，and alpha－thalassemia－2（3.7kb deletion）in a Laotian family［J］.Hemoglobin，1991，15（4）：297－302.

［9］ Chan AY，So CC，Chan LC，et al.A laboratory strategy for genotyping haemoglobin H disease in the Chinese［J］.J Clin Pathol，2007，60（8）：931－934.

［10］Xiong F，Sun M，Zhang X，et al.Molecular epidemiological survey of haemoglobinopathies in the Guangxi Zhuang Autonomous Region of southern China［J］.Clin Genet，2010，78（8）：139－148.

［11］Chen－Guang Zheng，Ming Liu，Juan Du，et al.Molecular spectrum ofα－andβ－globin gene mutations detected in the population of guangxi zhuang autonomous region，People′s Republic of China［J］.Hemoglobin，2011，35（1）：28－39.

［12］陈萍，林伟雄，李树全.3例Hb Westmead复合东南亚缺失型α地贫1的分析［J］.中华血液学杂志，2005，26（10）：619－611.