包翠芬，赵 艳，宋慧娟，张尤新

（辽宁医学院：1.科学实验中心；2.基础学院生物化学教研室，辽宁锦州121001）

重金属铅具有较强的神经亲和性，研究表明，铅暴露可导致儿童学习记忆认知能力改变及智力障碍。钙－钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ（Ca2＋／Calmodulin dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）信号通路在学习记忆方面发挥着重要作用，急性铅中毒可能通过抑制该通路中CaMKⅡ活性从而影响下游信号分子，造成对学习记忆功能的损伤，但是其机制目前还不完全清楚［1－4］。本实验通过使用CaMKⅡ的激活剂、抑制剂及铅对大鼠海马脑片进行处理，通过检测其下游信号分子cAMP反应元件结合蛋白质（CRE binding protein，CREB）、c－FOS的表达来探明急性染铅对Ca2＋／CaM－CaMKⅡ 信号转导通路的影响，进一步探讨CaMKⅡ是否在大鼠海马急性铅中毒中的信号转导具有开关作用，以阐明铅对学习记忆影响的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康SD大鼠，生后30d，雌雄各半（由辽宁医学院实验动物中心提供），动物合格证号：SYXK（辽）2003－0011；兔抗大鼠CREB、c－FOS多克隆抗体，购于Cell Signaling公司；辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗，购于北京中山金桥公司；醋酸铅购于沈阳化学试剂厂；PowerPac 3000电泳仪（美国Bio－Rad公司）；Trans－blot SD半干转膜仪（美国 Bio－Rad公司）；其余试剂由辽宁医学院科学实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 培养脑片样品制备 取生后30d大鼠，颈脱臼处死后迅速取出大脑海马，放入4℃的人工脑脊液（ACSF）内，将其横切为350μm左右的脑片，于六孔培养板中培养。培养过程中连续通入流速1mL／min的混合气体（95%O2＋5%CO2），温度32.5～33.5℃［5］。

1.2.2 急性染铅样品制备 上述样品稳定培养2h后，分为对照组（n＝5）和染铅组（n＝35）：染铅组加入20μmol／L醋酸铅，分别于注入0、3、7.5、15、30、60、120min收集脑片，对照组继续采用ACSF培养并与染铅组同时收集脑片［5－6］。

1.2.3 CaMKⅡ的激活剂、抑制剂及铅处理样品制备 上述样品稳定培养2h后，更换培养液，按培养液的种类分为4组（n＝5），（1）对照组：ACSF液；（2）激活剂组：含谷氨酸的 A CSF液（谷氨酸终浓度为5μmol／L）；（3）抑制剂组：含 K N－93的ACSF液（KN－93终浓度为100μmol／L）；（4）染铅组：含谷氨酸及醋酸铅的ACSF液（谷氨酸、醋酸铅终浓度分别为5、20 μmol／L）。继续培养30min后收集脑片［5］。

表1 改变CaMKⅡ活性对CREB、c－FOS活性及表达的影响（±s，n＝3）

表1 改变CaMKⅡ活性对CREB、c－FOS活性及表达的影响（±s，n＝3）

＊：P＜0.05，与对照组比较。

组别 p－CREB CREB p－c－FOS c－FOS对照组 0.292 5±0.003 6 0.532 5±0.025 2 0.254 6±0.026 70.407 0±0.025 5激活剂组 0.431 1±0.008 7＊ 0.514 0±0.037 8 0.395 5±0.033 2＊ 0.413 2±0.028 0抑制剂组 0.342 3±0.015 5＊ 0.558 4±0.038 6 0.104 8±0.010 6＊ 0.405 0±0.024 5染铅组 0.235 1±0.028 6＊ 0.561 9±0.029 7 0.136 6±0.012 1＊0.411 5±0.026 4

1.2.4 免疫印迹法测定CREB、c－FOS的活性 将收集的海马脑片样品立即放入4℃裂解缓冲液中，静止0.5h后超声粉碎组织，12 000r／min，4℃离心20min，取上清液。采用二喹啉甲酸法测定蛋白含量；按所测浓度稀释样品。取适量稀释后样品加入电泳槽进行电泳，转膜，半干转印，5%脱脂奶粉封闭后。分别加入一抗（兔抗大鼠磷酸化及非磷酸化CREB、c－FOS抗体，稀释度为1∶1 000）4℃过夜；TBST缓冲液洗脱后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体孵育1h，TBST缓冲液洗脱；ECL发光显色。采用β－actin作为内参。扫描电泳条带，采用UVP软件测定蛋白目的条带的灰度值。待测蛋白质含量＝目的条带灰度／内参条带灰度。

1.2.5 统计学处理 以SPSS 13.0软件统计对实验数据经内参校正后进行方差分析。所有数据均以±s表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 急性染铅对大鼠海马脑片CREB、c－FOS活性的影响免疫印迹结果显示，采用内参校正后，对照组CREB、c－FOS活性随时间延长无显著性变化；而染铅组CREB、c－FOS活性随时间延长呈显著性降低趋势，见图1。

图1 急性染铅对大鼠海马CREB、c－FOS活性的影响

图2 Western blot测定CREB、c－FOS活性及表达

2.2 谷氨酸、KN－93、铅对CREB、c－FOS表达的影响 谷氨酸通过活化CaMKⅡ蛋白使磷酸化CREB、c－FOS的活性分别增强了47%、54%，而对非磷酸化CREB、c－FOS的表达无显著性影响；采用 KN－93抑制CaMKⅡ的活性使CREB、c－FOS活性分别降低了20%～59%，而对总量CREB的表达无显著性影响；铅能够拮抗谷氨酸的作用，使谷氨酸诱导的CREB、c－FOS活性升高分别降低了45%～47%，而对总量CREB表达无显著性影响，见表1、图2。

3 讨 论

环境中的铅是影响婴幼儿智力发育、儿童学习记忆功能的神经毒性物质之一，铅中毒的作用机制研究一直是防治铅中毒领域的热点问题。目前研究表明，突触传递在学习记忆过程中发挥着重要的作用，而某些蛋白激酶参与了突触传递过程。其中Ca2＋／CaM－CaMKⅡ是突触后传递的主要通路之一。当大脑海马CA1区受到强烈刺激后，立即传导至神经使树突的谷氨酸受体激活，进而使与谷氨酸受体偶联的Ca2＋通道开放，引发Ca2＋内流及谷氨酸的释放，导致胞内Ca2＋浓度升高，使CaMKⅡ的Thr－286磷酸化导致其被激活。这种磷酸化能够使其在细胞内Ca2＋浓度下降的情况下仍然保持活性，此活化过程被认为是学习记忆的分子基础［7－8］。本研究采用体外应用激活剂（谷氨酸）和抑制剂（KN－93）以改变培养脑片中CaMKⅡ活性，同时采用醋酸铅处理脑片，以观察其对下游信号分子活性的影响［9］。

研究表明，CREB和c－FOS是 Ca2＋／CaM－CaMKⅡ下游通路的重要因子。当突触活化产生的Ca2＋内流激活腺苷酸环化酶，催化ATP合成cAMP，进一步激活蛋白激酶A，使其催化亚基进入核内促使CREB磷酸化，形成二聚体与cAMP反应元件结合，活化下游分子。而c－FOS作为第三信使，通过激活异源二聚体激活蛋白－1的结合位点从而完成CREB下游因子的信号转导［10－13］。本研究结果显示，大鼠海马脑片培养时，激活剂组活化的CREB、c－FOS表达量与对照组比较显著增强，而抑制剂组及染铅组活化的CREB、c－FOS的表达则显著降低，此结果提示急性铅中毒对Ca2＋／CaM－CaMKⅡ信号转导通路的影响可能通过抑制CaMKⅡ的活性，影响某些蛋白激酶的激活状态，从而降低下游信号分子CREB、c－FOS的磷酸化水平，改变CREB、c－FOS调节基因转录的能力，干扰基因表达和蛋白质的合成，导致学习记忆功能障碍［14］。研究表明，Ca2＋／CaM－CaMKⅡ通路在铅中毒导致学习记忆损伤中发挥着重要的作用，可能作为开启和关闭下游信号转导通路的靶点，对该通路的深入研究可能为揭示铅神经毒机制提出新的思路，为防治铅中毒提供新的理论依据和线索。

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