缪肖波，刘求真，姚开泰，肖广惠

（南方医科大学肿瘤研究所，广州510515）

胃癌是世界常见恶性肿瘤之一［1］，目前早期胃癌多采用手术治疗为主的综合治疗，而对于中晚期患者，化疗则是综合治疗的重要措施之一［2］。然而导致化疗失败的重要原因就是化疗过程中形成的多药耐药性（multidrug resistance，MDR）［3］。多药耐药性是指恶性肿瘤细胞接触一种抗癌药后，继而对多种结构不同、作用机制各异的其他抗癌药产生耐药性的现象［4］，其成为化疗失败以及缓解后复发的主要原因。因此，寻找能够逆转MDR的药物成为胃癌研究的热点。丙戊酸盐（Valproate）是一种短链脂肪酸，目前在临床上被作为一线药物用来治疗癫痫［5－6］，后有实验证明丙戊酸盐具有抑制组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）的作用［7］，这类抑制剂被称为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，是一种新型且有效的抗肿瘤药物，可促进组蛋白乙酰化，激活某些基因转录，诱导细胞生长停滞、促进细胞分化和凋亡，并具有抑制肿瘤血管生成和转移的作用［8］。丙戊酸盐作为抗肿瘤药物的临床实验正在进行。本实验选择SGC－7901和SGC－7901／VCR细胞作为实验对象，观察丙戊酸盐对耐药细胞SGC－7901／VCR耐药性的逆转作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人胃癌细胞株SGC－7901及其耐药株SGC－7901／VCR由中南大学湘雅医学院细胞中心提供，将细胞置入含青／链霉素100U／mL青／链霉素和10%胎牛血清的RPMI－1640培养液中，在37℃，5%CO2恒温培养箱密闭条件下培养，每3天换1次液。

1.2 主要试剂和药物 胎牛血清、RRPMI－1640培养液、青／链霉素（Gibco）；MTT（Sigma）；二甲亚砜（DMSO，Sigma）；长春新碱（VCR，深圳万乐药业）；丙戊酸盐（Chalbiochem）；Annexin V－FITC／PI细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物）；抗乙酰化组蛋白3（acetylated histone H3，AcH3）单克隆抗体、β－Actin抗体（Santa Cruz）。

1.3 MTT法检测SGC－7901及SGC－7901／VCR细胞对 VCR及丙戊酸盐的敏感性 以每孔5 000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积100μL，每组3孔，同时设空白对照（仅加培养基），分别加入 VCR（浓度梯度为10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.320、0.160和0.000μmol／L）或丙戊酸盐（浓度梯度为32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5和0.0mmol／L）培养48 h后，每孔加入5mg／mL的MTT 20μL，37℃继续培养4h后终止培养，小心吸弃孔内培养基，加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，室温孵育10min，微振荡器振荡10min，使结晶物充分溶解，以空白对照孔调零，测定OD值，绘制耐药曲线。IC50软件分析SGC－7901和SGC－7901／VCR细胞对VCR及丙戊酸盐的IC50，并计算耐药指数，对某一药物的RI＝耐药细胞IC50／亲本细胞IC50。

1.4 丙戊酸盐对耐药细胞SGC－7901／VCR耐VCR的逆转作用 制备单细胞悬液，接种于96空培养板，每孔5 000个细胞，37℃、5%CO2培养箱过夜，待细胞完全贴壁后，加入药物。MTT法检测丙戊酸盐对耐药细胞SGC－7901／VCR耐VCR的逆转时，VCR设8个药物梯度，分别为10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.320、0.160和0.000μmol／L；丙戊酸盐设3个药物梯度，分别为1.0、0.5和0.0mmol／L。共设3个实验组：（1）VCR；（2）0.5mmol／L ＋ VCR；（3）1.0mmol／L ＋ VCR。加入药物继续培养48h后，每孔加入5mg／mL的 MTT 20 μL，37℃继续培养4h后终止培养，小心吸弃孔内培养基，加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，室温孵育10min，微振荡器振荡10min，使结晶物充分溶解，以空白对照孔调零，测定OD值，绘制耐药曲线。观察耐药细胞SGC－7901／VCR对VCR的敏感性，计算IC50和逆转指数 （逆转指数＝使用逆转药物前IC50／使用逆转药物后IC50）。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 收集对数生长期的SGC－7901／VCR细胞，消化、计数、铺板，37℃、5%CO2培养箱中培养，待培养12h细胞完全贴壁后，进行不同处理（未处理组、1.0μmol／L VCR处理组、0.5mmol／L丙戊酸盐处理组、1.0 mmol／L 丙戊酸盐处理组、1.0μmol／L VCR ＋ 0.5mmol／L丙戊酸盐处理组和1μmol／L VCR＋1.0mmol／L丙戊酸盐处理组），药物作用48h后，收集所有细胞（包括液体中悬浮的细胞）后计数，调整细胞浓度为1×106／mL。SGC－7901／VCR细胞未处理组分别设空白对照管和凋亡检测管，其余药物处理组只设凋亡检测管。凋亡检测管反应容积为100μL，加入FITC－Annexin V和PI各5μL后室温避光孵育30min。孵育完成后，D－Hanks洗涤2次后D－hanks重悬，上BD公司FACSAria型号流式细胞仪检测细胞凋亡，并计算总凋亡率（早期凋亡＋晚期凋亡）。

1.6 Westernblot实验检测SGC－7901／VCR细胞中乙酰化组蛋白AcH3的表达 首先提取亲代细胞SGC－7901和耐药细胞SGC－7901／VCR的总蛋白，检测两细胞中AcH3的表达差异。继而用不同浓度（0.0、0.5、1.0或2.0mmol／L）的丙戊酸盐作用于SGC－7901／VCR细胞48h或同一浓度（1mmol／L）作用12、24、48h后，检测丙戊酸盐其影响AcH3表达的规律。为了明确丙戊酸盐对AcH3的特异性，4种处理方法（未处理、1.0μmol／L VCR、1.0mmol／L 丙戊酸盐和1.0μmol／L VCR＋1.0mmol／L丙戊酸盐）处理SGC－7901／VCR细胞48h后，检测细胞中AcH3的表达。提取的蛋白经BCA法测定蛋白浓度后，煮沸变性上样于SDS－PAGE凝胶进行电泳分离，转膜，封闭，然后依次结合AcH3单克隆抗体和HRP标记的二抗，将ECL发光液Solution A和Solution B按1∶1比例混合，Bio－Rad公司molecular Imager ChemiDocTM XRS＋成像系统下采集曝光图像。

1.7 统计学处理 数据采用SPSS13.0进行分析，计量资料以±s表示，两样本比较采用独立样本t检验分析；One－way ANOVA比较同一细胞不同处理组的差异；两细胞不同药物处理的凋亡率数据采用析因设计方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SGC－7901及SGC－7901／VCR细胞对 VCR及丙戊酸盐的敏感性 与亲代细胞SGC－7901相比，耐药细胞SGC－7901对 VCR 不敏感，IC50分 别为 （0.073±0.020）μmol／L 和（2.530±0.287）μmol／L，两者差异具有统计学意义（t＝ －14.793，P＝0.004），耐药倍数为36.0。而SGC－7901和SGC－7901／VCR细胞对丙戊酸盐的IC50分别为3.681±0.889 mmol／L和3.313±0.511mmol／L，两者之间差异无统计学意义（t＝0.621，P＝0.568），这表明 SGC－7901和 SGC－7901／VCR对丙戊酸盐的敏感性基本相同。根据丙戊酸盐抑制细胞增殖曲线可知，丙戊酸盐在0.5mmol／L和1mmol／L时，对SGC－7901和SGC－7901／VCR细胞的抑制作用较弱，细胞存活率大于60%，细胞毒性较弱，本研究选择这两个浓度作为逆转耐药时的药物处理浓度，见表1。

表1 MTT比较SGC－7901和SGC－7901／VCR细胞的耐药能力（±s，n＝3）

表1 MTT比较SGC－7901和SGC－7901／VCR细胞的耐药能力（±s，n＝3）

IC50细胞系VCR（μmoL） 丙戊酸盐（mmol／L）SGC－7901 0.073±0.020 3.681±0.889 SGC－7901／VCR 2.530±0.287 3.313±0.511 t－14.793 0.621 P 0.004 0.568耐药指数36.0 1.0

2.2 丙戊酸盐对SGC－7901／VCR细胞耐VCR的逆转作用与SGC－7901细胞相比，SGC－7901／VCR细胞对 VCR 的耐药指数约为36.0。为了检测丙戊酸盐对耐药细胞耐VCR逆转作用的效果，将丙戊酸盐与VCR联用，在0.5mmol／L或1.0 mmol／L丙戊酸盐存在的条件下，SGC－7901／VCR细胞对VCR的敏感性明显增加，IC50由（2.433±0.208）μmol／L分别降为（0.850±0.132）μmol／L和（0.433±0.104）μmol／L，且随着丙戊酸盐浓度的上升逆转作用增强，各处理组间差异有统计学意义（F＝139.826，P＝0.000），逆转指数分别为2.86和5.62，见表2。

2.3 丙戊酸盐与VCR联用可增加SGC－7901／VCR细胞的凋亡率 为了检测丙戊酸盐单用或联合VCR使用后对细胞凋亡的影响，将耐药细胞SGC－7901／VCR依次进行6种处理，分别为未处理、1.0μmol／L VCR处理、0.5mmol／L丙戊酸盐处理、1.0mmol／L 丙 戊 酸 盐 处 理、1.0μmol／LVCR＋0.5 mmol／L丙戊酸盐处理和1.0μmol／L VCR＋0.5mmol／L丙戊酸盐处理。48h后流式细胞术检测细胞凋亡结果显示凋亡率分别为（3.600±0.552）%、（11.600±2.193）%、（12.133±2.103）%、（17.967±2.616）%、（32.7±2.685）%和（41.900±3.659）%。除1.0μmol／L VCR处理组与0.5mmol／L丙戊酸盐处理组之间差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组之间的差异均有统计学意义（P＜0.05）。此结果表明丙戊酸盐与VCR联用可促进细胞的凋亡，且这种作用具有浓度依赖性，见图2。

表2 丙戊酸盐对SGC－7901／VCR细胞耐药性的逆转作用（n＝3）

图2 丙戊酸盐与VCR联用对SGC－7901／VCR细胞凋亡的影响（n＝3）

图3 丙戊酸盐诱导SGC－7901／VCR细胞中组蛋白的增加

2.4 丙戊酸盐逆转SGC－7901／VCR细胞耐药的机制 Western blot实验结果显示，与亲代细胞SGC－7901相比，耐药细胞SGC－7901／VCR的 AcH3的表达降低（图3A）。未处理、1 μmol／LVCR、1.0mmol／L丙戊酸盐和1μmol／L VCR ＋1.0 mmol／L丙戊酸盐等4种处理后 SGC－7901／VCR 细胞中AcH3检测结果显示：与未处理组相比，1.0mmol／L丙戊酸盐和1.0μmol／L VCR＋1.0mmol／L丙戊酸盐处理组AcH3表达明显增高，而1.0μmol／L VCR处理组无变化（图3B）。这说明丙戊酸盐能够增加SGC－7901／VCR细胞中AcH3的表达。用0.5、1.0或2.0mmol／L丙戊酸盐分别处理SGC－7901／VCR细胞48h后，AcH3的表达量随药物浓度的上升而逐渐增加（图3C）；用同一浓度（1.0mmol／L）的丙戊酸盐处理SGC－7901／VCR细胞12、24、48h后发现，随处理时间的延长，AcH3的表达量也逐渐增加（图3D）。这说明丙戊酸盐增加AcH3的表达具有浓度和时间依赖性。

3 讨 论

在近代肿瘤治疗进程中，MDR已成为影响化疗效果和远期预后的重要因素［9］。自1970年Bieder等［10］首次阐述 MDR以来，对MDR形成机制的研究持续存在。肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性是治疗失败的主要原因，也是临床所需要解决的难题［11］。由于肿瘤细胞发生MDR的机制十分复杂，因此选择理想的耐药细胞模型是解决问题最基本的条件。本研究选择的耐药细胞SGC－7901／VCR与亲代细胞 SGC－7901相比对VCR化疗药物均有较强耐药性，耐药倍数高达36.0，是研究逆转耐药的较好模型。Kim等［12］的实验发现多数胃癌组织中有HDAC1mRNA和蛋白高表达，这表明在胃癌组织中组蛋白去乙酰化酶的表达增加，而组蛋白的表达是明显降低的。亲代细胞SGC－7901与耐药细胞SGC－7901／VCR细胞作为胃癌细胞系，也具有此特点，因此可以选择胃癌细胞作为丙戊酸盐逆转耐药的研究对象。

组蛋白氨基端富含赖氨酸残基，对其中保守位点的乙酰化修饰可以影响DNA与转录调节复合物的结合，调控DNA的复制和修复、基因表达、染色质组装和细胞有丝分裂［13］。组蛋白的乙酰化状态由两类酶来决定，即组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HAT）和组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase，HDAC）［14］。这两类酶对组蛋白乙酰化作用调控的失衡，可导致染色质结构改变，使调节细胞周期、细胞分化、凋亡的基因转录失衡，从而导致细胞的恶变。HDACIs作为一类新型、有效的抗肿瘤化合物，可促进组蛋白乙酰化，激活某些基因转录，诱导细胞生长停滞、促进细胞分化和凋亡［15］。丙戊酸盐作为一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors，HDACIs），与SAHA、TSA 等 HDACIs相比，具有作用时间长，毒性作用较弱等优点［16］。而且本研究发现丙戊酸盐 对 SGC－7901 和 SGC－7901／VCR 细 胞 的 IC50分 别 为（3.681±0.889）mmol／L和（3.313±0.511）mmol／L，二者之间差异无统计学意义，这表明与SGC－7901相比，SGC－7901／VCR对丙戊酸盐的敏感性相同。本研究选取0.5mmol／L和1.0 mmol／L两个较低浓度丙戊酸盐与VCR联用，观察其逆转耐药效果，结果发现丙戊酸盐使SGC－7901／VCR细胞对VCR的敏感性明显增加，IC50由（2.433±0.208）mol／L分别降为（0.850±0.132）μmol／L和（0.433±0.104）μmol／L，逆转指数分别为2.86和5.62。

Keshelava等［17］在神经母细胞瘤的研究中发现，耐药细胞中组蛋白去乙酰化酶的表达明显增加，即乙酰化组蛋白表达明显降低。通过抑制HDAC的表达或降低其活性可增加多药耐药细胞对普通化疗药物的敏感性。为了探讨丙戊酸盐逆转耐药的机制，本实验首先检测了亲代细胞和耐药细胞中AcH3的表达，结果证实耐药细胞SGC－7901／VCR中AcH3的表达量明显低于亲代细胞SGC－7901。丙戊酸盐单独或与VCR联用后检测结果显示VCR不能增加AcH3的表达，而丙戊酸盐增加AcH3表达则具有浓度和时间依赖性。增加的乙酰化组蛋白通过多种途径杀灭肿瘤细胞，其中最重要的就是增加细胞凋亡［18］。因此，本实验将低浓度丙戊酸盐和VCR联用后流式检测细胞凋亡的变化，结果发现：与未处理组相比，单独丙戊酸盐或VCR处理细胞均可诱导凋亡但比例较低，而两药联用时耐药细胞SGC－7901／VCR细胞的凋亡率明显增加。因此，丙戊酸盐通过抑制去乙酰化酶增加乙酰化组蛋白（如AcH3）的表达，进而通过一系列机制促进细胞凋亡逆转耐药。

目前，许多组蛋白去乙酰化酶抑制剂类药物进入了临床实验和一线治疗，如 MS－275、他地那兰、belinostat、vorinostat、帕比司他等，均显示了较好的抗肿瘤效果［19］。作为一种新型非细胞毒的广谱抗肿瘤药物，HDACi具有良好的临床应用前景和价值，作为其中的一种，由于丙戊酸盐作用时间长、安全范围大等特点，特别是联合其他化疗药物时对化疗疗效的促进作用，将会使其应用得到越来越多的重视。

［1］ Alberts SR，Cervantes A，van de Velde CJ.Gastric cancer：epidemiology，pathology and treatment［J］.Ann Oncol，2003，14（2）：31－36.

［2］ Sasako M.Principles of surgical treatment for curable gastric cancer［J］.J Clin Oncol，2003，21（23Suppl）：274－275.

［3］ Kowalski P，Stein U，Scheffer GL，et al.Modulation of the atypical multidrug resistant phenotype by a hammerhead ribozyme directed against the ABC transporter BCRP／MXR／ABCG2［J］.Cancer Gene Ther，2002，9（7）：579－586.

［4］ Pastan I.Cottesman MM.Multidrug resistance［J］.Annu Rev Med，1991，42：277－286.

［5］ Eong MR，Hashimoto R，Senatorov VV，et al.Valproic acid，a mood stabilizer and anticonvulsant，protects rat cerebral cortical neurons from spontaneous cell death：a role of histone deacetylase inhibition［J］FEBS Lett，2003，542（1／2／3）：74－78.

［6］Phiel CJ，Zhang F，Huang EY，et al.Histone deacetylase is a direct target of valproic acid，apotent anticonvulsant，mood stabilizer，and teratogen［J］.J Biol Chem，2001，276（39）：36734－36741.

［7］ Gottlicher M，Minucci S，Zhu P，et al.Valproic acid defines a novel class of HDAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells［J］.EMBO J，2001，20（24）：6969－6978.

［8］ Marks PA，Richon VM，Rifkind RA.Histone deacetylase inhibitors：inducers of differentiation or apoptosis of transformed cells［J］.J Nail Cancer Inst，2000，92（15）：1210－1216.

［9］ Perez－Tomas R.Multidrug resistance：retrospect and prospects in anti－cancer drug treatment［J］.Curr Med Chem，2006，13（16）：1859－1876.

［10］Biedler JL，Riehm H.Cellular resistance to actinomycin D in Chinese hamster cells in vitro：Cross－resistance，radioautographic，and cytogenetic studies［J］.Cancer Res，1970，30（4）：1174－1184.

［11］Lin XS，Rui M.Rong L，et al.Reversal effect of tyroservatide（YSV）tripeptide on multi－drug resistance in resistant human hepatocellular carcinoma cell ine BEL－7402／5－FU［J］.Cancer Letters，2008，269（1）：101－110.

［12］Kim JH，Choi YK，Yang HK，et al.Downregulation of gelsolin and retinoic acid receptor beta expression in gastric cancer tissues through histone deacetylase 1［J］.J Gastroenterol Hepatol，2004，19（2）：218－224.

［13］Huang C，Sloan EA，Boerkoel CF.Chromatin remodeling and human disease［J］.Curr Opin Genet Dev，2003，13（3）：246－249.

［14］Khochbin S，Verdel A，Lemercier C，et a1.Functional significance of histone deacetylase diversity［J］.Curt Opin Genet Dev，2001，11（2）：162－166.

［15］Marks PA，Richon VM，Rifkind RA.Histone deacetylase inhibitors：inducers of differentiation or apoptosis of transformed cells［J］.J Nail Cancer Inst，2000，92（15）：1210－1216.

［16］Vandermeers F，Hubert P，Delvenne P，et al.Valproate，in combination with pemetrexed and cisplatin，provides additional efficacy to the treatment of malignant mesothelioma［J］.Clin Cancer Res，2009，15（8）：2818－2828.

［17］Keshelava N，Davicioni E，Wan Z，et al.Histone Deacetylase 1Gene Expression and Sensitization of Multidrug－Resistant Neuroblastoma Cell Lines to Cytotoxic Agents by Depsipeptide［J］.J Natl Cancer Inst，2007，99（14）：1107－1119.

［18］Burgess A，Ruefli A，Beamish H，et al.Histone deacetylase inhibitors specifically kill nonproliferating tumour cells［J］.Oncogene，2004，23（40）：6693－6701.

［19］焦杰，徐文方.新型抗肿瘤药组蛋白脱乙酰基抑制剂的临床研究进展［J］.中国新药与临床杂志，2009，28（3）：161－163.