陈黄琴 黄彬

（湖北科技学院 口腔教研室，咸宁 437100）

牙齿酸蚀症是指在没有细菌参与的情况下，由于酸的化学侵蚀或螯合作用，牙体表面硬组织局部性、病理性、慢性进行性丧失的一种疾病[1]。釉质酸蚀表现为一种向心性的矿物质溶解过程，直至暴露釉质下方的牙本质。脱矿牙本质中，有机质的存在能阻挡离子的扩散，减少酸蚀底物的丧失[2]，并能保护剩余的脱矿牙本质抵挡刷牙等机械性磨损[3]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类含Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶，是酸蚀症过程中降解牙本质有机质的主要蛋白水解酶之一。鉴于保存脱矿的牙本质有机质有利于减缓酸蚀症的发展，寻找、使用MMPs抑制剂，通过降低有机质的降解间接影响酸蚀进程就显得十分重要。绿茶多酚，特别是表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是MMPs的天然抑制剂，对多种肿瘤细胞系的MMP-2和MMP-9有明显的抑制作用[4]。本试验采用双盲随机对照的方法，在自然口腔生态环境下，研究天然药物EGCG对牙本质抗酸蚀作用的影响。为开发天然药物防治酸蚀症提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料及配制方法

EGCG（质量分数为98%，Sigma公司，美国）。Ⅰ型胶原羧基端肽（carboxy-terminal telopeptide of typeⅠcollagen，ICTP）的检测设备γ放射免疫计数仪（FJ-2008PS型，西安核仪器厂）由咸宁市中心医院放射免疫科提供。

EGCG凝胶的制备：先将EGCG溶于去离子水中，一次性抽滤器抽滤消毒，备用。将羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose sodium，CMC）在持续搅拌的状态下缓慢均匀地分散到去离子水中，待其完全溶解，滤去杂质后，高温高压消毒备用。再将消毒过的CMC水凝胶放置在振荡器上，边振荡边逐滴滴加EGCG溶液，直至两者充分混合，EGCG和CMC的终质量分数分别为1%和2%。安慰剂凝胶（CMC凝胶）制法同上，只是不添加EGCG溶液。共制备凝胶制品64份，每种各32份。每个凝胶制品包装一致，只是编号不同。只有负责编号的老师知道不同编号对应的凝胶种类，此人不再参与本试验的其他内容。

1.2 研究对象

研究对象为湖北科技学院在校大学生，年龄18～22岁。研究者利用新生体检数据，根据Eccles和Jenkins[5]提出的牙齿酸蚀症诊断标准和O’Sullivan[6]提出的牙齿酸蚀症评分指数，选取酸蚀症志愿者64名为研究对象，其中男生35名，女生29名。64名志愿者的酸蚀症损害为釉质缺失、牙本质暴露（釉牙本质界可见），或者釉质和牙本质缺失达牙本质深层，即酸蚀指数为3～4分。所有志愿者均无活动性龋、无牙龈出血、无系统性疾病，近2周无服药史。试验前征得所有学生的同意，并签署知情同意书。

1.3 研究方法

1.3.1 个别托盘的制作及使用 将成品热固化成形牙套放入沸腾的热水中约5 s，使其软化，将水甩干后将软的牙套放入志愿者口中，用手指紧压牙齿的舌面、唇侧和咬合面，同时用舌头顶住内面挤出里面的空气和水，15 s后取出放进冷水中使牙套凝固。用小剪刀剪去牙龈以下的部分即制作完成。使用时，在托盘3┼3的区域注入1 mL凝胶，放入口中轻轻咬合，使得凝胶均匀分布在各个牙面。要求志愿者在睡时使用，第2天清晨起床后取下（每天戴用约8 h）。

1.3.2 培养液的收集及检测 取出托盘后，立即在托盘内注入0.01 mol·L-1的PBS缓冲溶液1 mL，放在摇床上轻轻摇晃10 min，收集上下颌托盘内的PBS溶液装入试管中，置于漩涡振荡器上振荡1 min使其充分混合。从混合溶液中吸取100 μL，使用芬兰Orion Diagnostica公司提供的ICTP放射免疫试剂盒测定ICTP的质量浓度。

1.4 试验设计

试验开始前2周，给每位志愿者发放无氟牙膏，要求志愿者每天早晚2次用其刷牙，同时随机分发带有不同编号的凝胶制品。试验组和对照组各32名，分别使用EGCG凝胶和CMC凝胶。试验开始前1 d，收集培养液进行ICTP基线测量，这时托盘中注入的是CMC凝胶，以后每日使用随机分发的带有编号的凝胶，持续4周。于试验的第1、2、3、4周清晨收集培养液，进行ICTP质量浓度的测定，方法见1.3.2。

1.5 统计分析

采用SPSS统计学软件13.0处理数据，各组均数的比较用单因素方差分析和Newman-Keul法进行统计分析。

2 结果

试验组和对照组在不同的观察时间点测定的ICTP质量浓度见表1。由表1可见：凝胶的种类和使用时间对ICTP的质量浓度均有影响。对照组（CMC凝胶组）ICTP的质量浓度随着时间的增长呈现上升趋势（P＜0.05），到第3周趋于平稳，3、4周ICTP质量浓度的差异没有统计学意义（P＞0.05）。试验组（EGCG凝胶组）ICTP的质量浓度则呈现出随时间增长而下降的趋势（P＜0.05），到第3周时也基本趋于稳定，3、4周的差异无统计学意义（P＞0.05）。对于同一时间点试验组和对照组ICTP质量浓度进行比较，除了2组的基线测量值没有差异（P＞0.05）之外，其余各时间点的差异均有统计学意义（P＜0.05），对照组均高于试验组。

表 1 不同时间点对照组和试验组的ICTP测量结果Tab 1 ICTP values at different time points in the control and experimental groups μg·L-1

3 讨论

近年来，流行病学调查[7]表明：酸蚀症在人群中普遍存在，且发病率呈上升趋势。有学者[8]调查了我国1 949名3～5岁学龄前儿童的上颌切牙，发现有112名（占5.75%）患有牙酸蚀症。酸蚀症可引起牙齿的釉质损害，严重者可侵犯牙本质和牙髓，导致牙齿过敏，甚至牙髓暴露及牙齿折断。目前，临床上常用的治疗酸蚀症的药物主要是氟化物及其衍生物，然而随着局部应用氟化物浓度、频率的增加以及多种氟化物制剂的广泛使用，易导致耐氟菌株的选择性生长，使其临床应用受到一定的限制[9]。因此，研究开发能有效阻止因酸蚀造成的牙体硬组织慢性损伤的药物显得十分重要。酸蚀症是一个多因素的疾病，与频繁消费酸性饮料及食物、患某些疾病使胃酸频繁进入口腔内接触牙齿等有一定的关系。本试验选取的研究对象是在校大学生，一般无频繁呕吐、反胃等现象，造成酸蚀症的原因主要是频繁消费酸性饮料，因而降解牙本质有机质的蛋白水解酶主要是MMPs而不是胃蛋白酶和胰蛋白酶。已有研究[4]证实：EGCG能显著抑制MMP-2和MMP-9的活性。另有学者[3]发现：与水相比，用绿茶漱口能减少酸蚀或磨耗情况下牙本质的磨损。因此，选用EGCG作为研究药物理论上是可行的。

本试验选择ICTP作为衡量胶原降解程度的指标。ICTP是由MMPs介导的成熟的Ⅰ型胶原（牙本质有机质的主要成分）降解过程中产生的特异性物质。检测ICTP水平是定量分析MMPs降解Ⅰ型胶原酶活性最可靠的方法之一。在已知的与硬组织吸收有关的胶原降解蛋白酶中，只有MMPs能够产生ICTP，其释放只能被MMPs抑制剂特异性抑制，而不能被半胱氨酸蛋白酶抑制剂所抑制，因此检测ICTP的敏感性、特异性远远高于检测胶原其他片段如羟脯氨酸等。本试验结果显示，凝胶中添加EGCG使得ICTP的质量浓度呈现下降趋势，与对照组相比差异有统计学意义，说明EGCG能够降低牙本质有机质的降解，从而具备减缓牙本质酸蚀进程的潜能。EGCG能减少酸蚀症患牙培养液中ICTP质量浓度的原因主要有两个。1）EGCG含有3,4,5-三羟苯甲酰基团，能通过氢键和多酚疏水作用稳定胶原。研究[10]证实：EGCG比一般的化学交联剂如戊二醛、碳化二亚胺更能稳定胶原，保护胶原链不被胶原酶降解。2）EGCG能直接抑制MMP-2和MMP-9的活性。MMP-2和MMP-9是降解牙本质胶原主要的蛋白水解酶。酸蚀发生时，牙本质脱矿，由于唾液的缓冲作用使酸蚀环境由酸性逐渐变成中性，在此变化过程中牙本质有机质的胶原纤维暴露，暴露的胶原蛋白首先被MMP-8剪切成片段，然后被MMP-2和MMP-9进一步降解[11]。因此，EGCG作为MMP-2和MMP-9的抑制剂，能有效降低牙本质胶原的降解。对照组ICTP的含量表现为逐步上升的趋势，推测其主要原因是由于唾液的流动性和缓冲能力等因素对釉质酸蚀有一定的保护作用[12-13]。唾液中的钙磷浓度处于过饱和状态，能够在釉质酸蚀早期弥补矿物质的丧失，而且唾液中的氟可通过形成氟磷灰石样结构增强表面溶解晶体的再矿化，比羟磷灰石更好地抵抗酸蚀作用[14]。对照组中虽然没有使用EGCG，但是含有CMC凝胶的托盘大大减少了唾液与牙面的直接接触，从而降低了唾液及唾液获得性膜对牙齿酸蚀的保护作用，因此，对照组ICTP的含量表现为逐步上升的趋势。综上所述，EGCG能有效减少脱矿牙本质胶原的降解，提高牙本质抗酸蚀的能力，具有进一步研究、开发的潜能。

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