蔡群芳，李淑琴，黄用豪

(1.海南医学院热带医学与检验医学院，海南海口571199；2.海南农垦中学，海南海口570226；3.海南省热带病重点实验室，海南海口571199)

海南岛库蚊和伊蚊基因组弹状病毒核蛋白内生病毒片段的鉴定和特征描述

蔡群芳1，李淑琴2，黄用豪3*

(1.海南医学院热带医学与检验医学院，海南海口571199；2.海南农垦中学，海南海口570226；3.海南省热带病重点实验室，海南海口571199)

目的鉴定和特征描述海南岛蚊子基因组弹状病毒核蛋白内生病毒片段。方法收集海南岛内的库蚊、伊蚊和按蚊，分别提取各类蚊子的总基因组，以此为模板PCR扩增弹状病毒类核蛋白内生病毒片段，并通过测序和分子生物学方法对其特征进行鉴定和描述。结果在海南岛库蚊和伊蚊基因组中获得弹状病核蛋白内生病毒片段，采用测序和分子生物学方法分析和鉴定了该内生病毒片段在进化上高度保守。结论数据分析证明蚊子基因组弹状病毒核蛋白内生病毒片段与弗兰德斯病毒(Flanders virus)相关，这种病毒在海南岛还没见报导过；初步表明蚊子基因组弹状病毒核蛋白内生病毒片段是在蚊子扩散到海南岛来之前就已经整合到蚊子基因组当中的。

弹状病毒；核蛋白；内生病毒片段；基因组；蚊子

单个病毒基因或是整个病毒基因组在感染宿主时会整合到宿主生殖细胞基因组当中，这些整合到宿主基因组中的病毒基因片段或是整个病毒基因组，称之为内生病毒片段(Endogenous viral elements，EVEs)，它如宿主其他的基因片段可以进行垂直遗传[1-2]。内生病毒片段被认为是古代基因的生物化石，能够反映宿主和病毒之间的进化关系[3-5]。最早鉴定和描述的内生病毒片段是类逆转录酶病毒片段。人们在许多动物基因组里发现很多来源于逆转录病毒基因的内生病毒片段[6-7]，人类基因组中有大约8%的基因片段是由来源于逆转录病毒基因的内生病毒片段组成[8-9]。据最近报道，哺乳动物基因组中含有许多来源于非逆转录病毒的内生病毒片段，其中博尔纳病毒(Borna-like NP elements，EBLNs)核蛋白内生病毒片段研究最广泛[10-11]。

蚊子能够传播多种病毒包括黄病毒属和弹状病毒属。在病毒和蚊子长期的相互作用中，会有许多病毒片段整合到蚊子基因组当中。报道称在伊蚊基因组内发现大量与黄病毒属相关的内生病毒片段[12-13]。以前通过实验证实的在蚊子基因组内与弹状病毒属相关的内生病毒片段很少，但随着分子生物学和生物信息学的发展，人们通过分子生物信息学方法对蚊子基因组进行分析发现蚊子基因组内同样含有大量的与弹状病毒属相关的内生病毒片段，尤其是弹状病毒核蛋白内生病毒片段在蚊子的基因组中含量丰富[14]。

在本文中，我们对海南岛蚊子基因组弹状病毒核蛋白内生病毒片段进行研究，我们通过实验证明在伊蚊和库蚊基因组内发现弹状病毒核蛋白内生病毒片段，而在按蚊中没有发现这些内生病毒片段；另外我们分析证明了这些内生病毒片段在进化上比较保守。

1 材料与方法

1.1 样品收集收集海南岛内的蚊子，按种类、性别和地理位置对其进行分类，每一类以50只为一组。

1.2 蚊子基因组的提取利用德国QIAgen高通量研磨器(Mixer Mill MM300)对蚊子进行研磨，利用基因组提取试剂盒对蚊子总基因组进行提取，并纯化。

1.3 PCR方法按1.2步骤提取的蚊子基因组作为模板；按常规的PCR方法扩增蚊子基因组中弹状病毒核蛋白基因片段；利用引物C1(5'-ATGTACGTGAGTGACAGCTT-3')和C2(5'-TCACATTTGCTGAATGGTCC-3')扩增伊蚊基因组中的弹状病毒核蛋白基因片段；利用引物A1(5'-ATGGCACAAGCGGAAATTAA-3')和A2(5'-CTAGGGTTGTCCGCCCA-3')扩增库蚊基因组中的弹状病毒核蛋白基因片段。

1.4 测序与序列分析回收阳性克隆，寄给生物公司进行测序。应用EditSeq和SeqMan software (DNASTAR Inc)这两种软件对序列进行分析，通过BLASTn和BLASTp两种软件进行比对分析。所参考的弹状病毒序列在基因库(GenBank)中都有记录。

1.5 系统进化树的构建应用Clustal W(Version 1.74)和MEGA(Version 4.0)两种软件构建弹状病毒核蛋白内生病毒片段系统进化树。

2 结果

2.1 蚊子基因组弹状病毒核蛋白内生病毒片段扩增分子生物学和基因组学方法分析表明蚊子基因组内含有一些与弹状病毒核蛋白基因相关的内生病毒片段，为了证实这些片段的存在，我们利用PCR技术扩增蚊子基因组弹状病毒核蛋白内生病毒片段。如图1所示，在伊蚊和库蚊基因组中扩增出弹状病毒核蛋白内生病毒片段，而在按蚊基因组中没有扩增出来，这说明了弹状病毒与蚊子种类之间存在相对特异性。

2.2 与基因库中所有记录的弹状病毒核酸蛋白基因片段的比对氨基酸序列分析表明，所扩增的基因片段与基因库中伊蚊氨基酸序列比对为96%(登录号XP_ 001657655.1)，与库蚊氨基酸序列比对为97%(登录号XP_001851570.1)，说明它们在进化上是比较保守的。这两个扩增的序列都含有完整的阅读框，分别含有468个氨基酸和479个氨基酸。

为了鉴定所扩增的基因片段与哪些弹状病毒相关，我们用所扩增的片段与基因库中所有记录的弹状病毒核酸蛋白基因片段进行比对分析，如图2所示，所扩增的基因片段与弗兰德斯病毒(Flanders virus)极大相关，相似率达到45%。

图2 海南岛蚊子基因组弹状病毒核蛋白内生病毒片段与弗兰德斯病毒(Flanders virus)核蛋白基因序列相关性分析。

2.3 所有蚊子真核细胞染色体的比对分析利用tblastn软件对所有的真核细胞染色体进行比对分析，如表1所示，存在于蚊子基因组中的弹状病毒核蛋白内生病毒片段也存在于硬蜱基因组当中。

表1 蚊子基因组和硬蜱基因组中的弹状病毒核蛋白内生病毒片段

2.4 对弹状病毒核蛋白序列进行系统进化树分析对弹状病毒核蛋白序列进行系统进化树分析，如图3所示，整合到蚊子基因组中的弹状病毒核蛋白序列与狂犬病毒属和果蝇sigma病毒同处于一个分支。

图3 弹状病毒核蛋白内生病毒片段系统进化树分析

3 讨论

来自泰国、德克萨斯(美国)、喀麦隆、马达加斯加、日本、泰国、马达加斯加、意大利和法国不同地域的白纹伊蚊基因组中都能扩增出名为细胞沉默剂病毒(Aedes albopictus cell silent agent，CSA)的基因片段，并且这些片段在地域上是高度保守的[12]。但是Roiz等[13]报道一些整合在意大利的白纹伊蚊基因组中黄病毒内生病毒片段可以形成新的一个分类，这个分支在进化上是独立的，这些数据表明蚊子宿主和病毒之间存在着相对特异性。此外，新整合事件，或是独立的整合事件或是一些不稳定的内生病毒片段也造成了地域上基因库中的内生病毒片段的差异性[15-16]。我们实验结果表明弹状病毒核蛋白内生病毒片段在地域上是高度保守的。此外，本实验还发现蚊子基因组弹状病毒核蛋白内生病毒片段与弗兰德斯病毒(Flanders virus)核蛋白基因序列相关，该病毒至今未在海南岛有报道，初步证明了弹状病毒核蛋白基因是在蚊子扩散到海南岛来之前就整合如蚊子基因组中，因此海南蚊子可能跟其他地区的蚊子来自同一个地域的祖先。

蚊媒病毒包含黄病毒和弹状病毒，弹状病毒属于非逆转录病毒。黄病毒内生病毒片段已被证明广泛存在于蚊子基因组中，但是弹状病毒内生病毒片段在蚊子基因组中的存在还少有报道[12-13]。分子生物学和基因组学方法揭示了蚊子基因组中同样也存在大量的弹状病毒内生病毒片段，这些内生病毒片段主要来源于弹状病毒核蛋白、聚合酶和糖蛋白G基因[14]。在千万年的历史进化中博尔纳病毒(BDV)的核蛋白内生病毒片段表现出高度保守；虽然对博尔纳病毒(BDV)的核蛋白内生病毒片段的整合机制还不是很清楚，但分析可以表明，存在于哺乳动物基因组中的博尔纳病毒(BDV)的核蛋白内生病毒片段比存在于哺乳动物基因组中的非逆转录病毒的内生病毒片段还要早[10-17]。来源于逆转录或非逆转录病毒内生病毒片段在哺乳动物基因组中的大量存在，促使我们对蚊子基因组中弹状病毒核蛋白内生病毒片段的研究。实验证明来源于海南岛蚊子基因组中的弹状病毒核蛋白内生病毒片段在地域上是高度保守，这进一步表明病毒核蛋白基因在进化中是高度保守的，因此病毒核蛋白基因可以作为分子化石用来研究病毒与哺乳动物进化上的相关信息。

按蚊、库蚊和伊蚊是海南岛的三种主要蚊种，用这三种蚊子基因组作为模板研究内生病毒片段具有代表性意义。我们认为海南岛蚊子基因组中含有很多种内生病毒片段，是一个内生病毒片段的自然基因库。可利用的序列信息的缺乏和不完善是研究蚊子基因组内生病毒片段的一大障碍。研究一些最近发生的或是不稳定的内生病毒片段需要蚊子个体水平的基因序列。要想进一步研究蚊子基因组内生病毒片段，需要更多的样本和更多可利用的蚊子基因序列信息。

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Identification and characterization Rhabdovirus nucleoprotein-like endogenous viral elements in the genomes of Aedes and Culex mosquitoes in Hainan island.

CAI Qun-Fang1,LI Shu-Qin2,HUANG Yong-Hao3.1.School ofTropical and Laboratory Medicine,Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA;2.Nongken High School of Hainan Province,Haikou 570226,Hainan,CHINA;3.Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Disease,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo identify and characterize rhabdovirus nucleoprotein(NP)-like endogenous viral elements(EVEs)in the genomes of mosquitoes from Hainan Island.MethodsWild mosquito samples were collected from Hainan Island and their total DNA was isolated from these moquitoes as a template for amplifying Rhabdovirus NP-like EvEs,which were identified and characterized by PCR methods and bioinformatic analysis.ResultsRhabdovirus NP-like EVEs amplified by PCR showed positive in the genomes of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus mosquitoes but negative in Anopheles sinensis mosquitoes.Sequencing analysis revealed that the amplified sequence was homologous to the NP gene of Flanders virus.Rhabdovirus NP-like EVEs contained an intact open reading frame (ORF)and were expressed as mRNA.Phylogenetic analysis showed that rhabdovirus NP-like EVEs derived from mosquitoes grouped into a clade and were closely related to Rabies virus and Drosophila sigma virus.ConclusionsRhabdovirus NP-like EVEs are found to be related to Flanders virus,which has never been isolated in Hainan Island.NP-like EVEs might be integrated into the mosquito genomes prior to its dispersal.

Rhabdoviruses;Nucleoprotein;EVEs;Genomes;Mosquitoes.

R372

A

1003—6350(2012)09—001—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.09.001

2012-01-13)

海南医学院科研培育基金(编号：HY2010-006)

蔡群芳(1981—)，女，四川省资中县人，讲师，研究方向：临床生物化学与分子生物学。

*通讯作者：黄用豪。E-mail：hyh1027@21cn.com