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结核分枝杆菌Rpf-DNA疫苗对Mtb感染小鼠免疫保护作用的研究

2012-09-02邢爱英刘忠泉刘洋贾红彦李自慧郑晓静曹廷明杜凤娇杜博平古淑香张宗德

中国防痨杂志 2012年8期
关键词:生理盐水空白对照质粒

邢爱英 刘忠泉 刘洋 贾红彦 李自慧 郑晓静 曹廷明 杜凤娇 杜博平 古淑香 张宗德

近几年来,全球TB患者有不断增加的趋势,我国TB发病率居世界第二。耐药结核病、流动人口罹患TB、Mtb和HIV的双重感染者的增加以及BCG对成年人保护作用的不佳(0%~70%)[1]使得我国结核病的预防控制工作进一步加剧。结核疫苗的研制一直是结核预防控制工作方面的一大主要措施。笔者在克隆、表达复苏因子(resuscitation-promoting factor,Rpf)蛋白质的基础上,应用5个复苏因子蛋白质疫苗免疫BALB/c小鼠后,用Mtb标准株H37Rv感染BALB/c小鼠,发现复苏因子D、E有很高的免疫原性[2-3]。因此,笔者构建了 Mtb Rpf D、Rpf E-DNA疫苗,探讨 Rpf D及 Rpf E-DNA疫苗对感染Mtb的BALB/c小鼠的免疫特性。

材料和方法

一、材料

SPF级BALB/c型小鼠(4周龄)购至自北京维通利华实验动物技术有限公司;H37Rv标准株为本室保存;Glas-col吸入暴露系统为 Glas-col公司产品;佐剂阳离子聚合物购自厦门太阳马生物工程有限公司;IFN-γ、IL-2、IL-12 检测试剂盒购自美国R&D公司;淋巴细胞增殖试剂(Cell Counting Kit CCK-8)购自美国罗氏公司;非放射性细胞毒性检测试剂盒购自美国Promega公司;兔抗小鼠抗血清抗体购自Sigma公司;His Bind Purification Kit(融合标签蛋白纯化试剂盒)购自美国Novagen公司。

二、方法

1.Rpf D、Rpf E-DNA质粒疫苗的构建和表达:具体方法参考文献[4]。

2.转染质粒制备:按照梭华Sofast基因转染试剂盒操作说明书制备。

3.免疫动物:180只SPF级4周龄BALB/c雌性小鼠,平均分为6组。即空质粒组、Rpf D质粒组、Rpf E质粒组、BCG组、生理盐水组、空白对照组。空质粒组、Rpf D质粒组、Rpf E质粒组和生理盐水组分别背部皮下接种空质粒转染质粒、Rpf D-DNA转染质粒、Rpf E-DNA转染质粒、生理盐水各200μl;而空白对照组不免疫。BCG组在各组第3次免疫时进行BCG免疫(每只免疫BCG 105CFU),3周后第2次免疫;再过3周第3次免疫。

4.感染动物:第3次免疫后的第4周,用含吐温80的7H9液体培养基(自配)复苏培养H37Rv并以PBS稀释至5×107CFU,分别取10ml雾化感染各组小鼠。

5.淋巴细胞的制备:在感染后第8周各组采用直接抽选法随机抽取24只小鼠,眼球取血1.0ml和取脾脏及全肺。血液分离血清备用,脾脏用分子筛分离淋巴细胞,淋巴细胞分层液纯化淋巴细胞,加入防冻液液氮中保存。全肺取少许组织进行病理检查,余下的组织10倍等比稀释,各取100μl涂于7H11平板,置于37℃恒温培养箱培养,进行菌负荷实验。每组余6只观察生存状态。

6.血清的免疫学试验:血清按ELISA方法分别检测血清中抗IgG抗体和IFN-γ[5]。

7.淋巴细胞增殖试验(lymphocyte proliferation test):复苏淋巴细胞,调整细胞浓度为1×105/ml,取48孔板,加300μl含两性霉素B(终浓度为1mg/L)的1640培养基和100μl淋巴细胞,并设不加细胞的空白对照孔,细胞培养箱培养24h,加入10μl(800μg/ml)复苏因子D或E,并设不加复苏因子蛋白质的阴性对照和加入1μl(1000μg/ml)刀豆球蛋白A(Concanavalin A,Con A)作为阳性对照。3d后取300μl上清ELISA方法检测IFN-γ和IL-12,IL-2,细胞培养板加入10μl CCK-8,细胞培养箱培养4h时,450nm测A值。淋巴细胞增殖率(SI)=刺激孔A值/对照孔A值×100%。

8.CTL杀伤效应实验(CTL killing activity):复苏小鼠脾淋巴细胞并调整细胞浓度为1×105/ml,采用美国Promega公司生产的非放射性细胞毒性检测试剂盒(LDH法)检测。

9.组织病理分析:肺组织作病理切片,进行HE染色[6]。

10.小鼠肺组织CFU计数,上述7H11平板培养第20和30天分别计数细菌菌落。

11.统计学处理:采用SPSS 11.5软件分别对疫苗免疫组(RpfD、RpfE)与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组进行F检验。

结 果

1.组织病理形态:空白对照组、空质粒组、生理盐水组:肺颜色灰白,表面有大量粟粒性结核病灶(图1)。RpfD质粒组、Rpf E质粒组、BCG组:肺颜色鲜红,表面光滑,散在少量粟粒性结核病灶(图2)。

2.血清抗体及IFN-γ检测:Rpf D、E质粒组血清抗体与其他各组比较差异有显著统计学意义(P值均<0.01);Rpf D、E质粒组IFN-γ与BCG组比较差异有统计学意义(P值均<0.05);Rpf D、E质粒组IFN-γ与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义(P值均<0.01)。Rpf抗体及IFN-γ在RpfD组与RpfE组之间差异均无统计学意义(P值均<0.05)(表1)。

RpfD质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较,RpfD抗体F值分别为45.6,43.2,45.1,45.7,P值均<0.01。IFN-γF值分别为10.2,15.6,17.8,17.3,RpfD 质粒组与 BCG 组比较P<0.05,与其余各组比较P值均<0.01。RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较,RpfE抗体F值分别为51.5,53.6,51.0,52.2,P值均 <0.01。IFN-γF值分别为12.4,17.5,21.1,20.7,RpfE质粒组与BCG组比较P<0.05,与其余各组比较P值均<0.01。

3.淋巴细胞增殖实验及杀伤实验:Rpf D、E质粒组CCK-8与空质粒组、BCG组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义(P值均<0.05);Rpf D、E质粒组杀伤实验(LDH)与空质粒组、BCG组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义(P值均<0.05);CCK-8及LDH 在Rpf D组与Rpf E组之间差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

RpfD质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较,CCK-8F值分别为9.5,10.1,10.0,9.0,P值均<0.05。LDHF值分别为8.8,14.5,13.7,11.9,P值均<0.05。RpfE 质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较,CCK-8F值分别为11.2,12.9,11.7,10.3,P值均<0.05。LDHF值分别为8.1,12.5,11.6,11.1,P值均<0.05。

RpfD质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较,IL-12F值分别为5.0,1.9,2.3,2.7,P值均>0.05。IL-2F值分别为12.5,14.6,13.5,13.9,P值均<0.05。IFN-γF值分别为7.8,12.6,8.7,8.3,P值均<0.05。RpfE 质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较,IL-12F值分别为 3.3,1.7,1.5,1.3,P值均>0.05。IL-2F值分别为12.0,13.6,13.1,13.2,P值均 <0.05。IFN-γF值分别为 11.3,16.4,14.7,14.2,P值均<0.05。

5.肺病理检测:Rpf D质粒组、Rpf E质粒组无明显炎症灶(图3,4);BCG组有少量小面积炎症灶(图5);空质粒组、生理盐水组、空白对照组有大量且面积大的炎症灶(图6~8)。

表1 小鼠血清 Rpf D、Rpf E抗体(A 值)和IFN-γ(pg/ml)检测结果(±s)

表1 小鼠血清 Rpf D、Rpf E抗体(A 值)和IFN-γ(pg/ml)检测结果(±s)

.04 0.03±0.01 IFN-γ(pg/ml) 43.9±24.8 45.9±21.0 21.0±11.0 7.9±4.9 4.7±2空质粒组 生理盐水组 空白对照组抭体(A值) 0.32±0.1 0.39±0.1 0.02±0.01 0.01±0.0 0.09±0 RpfD质粒组 RpfE质粒组 BCG组.12 5.8±4.7

表2 细胞免疫原性检测结果[SI/CTL,(±s)%]

表2 细胞免疫原性检测结果[SI/CTL,(±s)%]

SI/CTL(%) Rpf D质粒组 Rpf E质粒组 BCG.0±8.4 116.0±2.2 LDH(CTL) 32.0±3.2 30.0±4.2 16.0±5.9 3.3±1.5 6.7±0.5 7质粒组 空质粒组 生理盐水组 空白对照组CCK-8(SI) 176.0±4.2 183.0±4.3 101.0±1.1 100.0±6.8 104.3±3.5

表3 淋巴细胞增殖上清IL-12、IL-2和IFN-γ检测结果[(±s)pg/ml]

表3 淋巴细胞增殖上清IL-12、IL-2和IFN-γ检测结果[(±s)pg/ml]

.2 20.0±17.2 25.0±15.3 IL-2 9.5±2.4 9.2±1.2 2.4±2.1 1.2±0.3 1.8±1.0 1.5±0.7 IFN-γ 22.2±5.7 28.7±14.4 16.1±10.1 9.8±1.6 13.2±2空质粒组 生理盐水组 空白对照组IL-12 21.0±15.2 23.0±14.2 27.0±17.8 22.5±20 Rpf D质粒组 Rpf E质粒组 BCG组.1 15.7±2.9

图3 Rpf D质粒组HE×10;无明显炎症灶,无渗出,肺组织完整。图4 Rpf E质粒组HE×10;无明显炎症灶,无渗出,肺组织完整。图5 BCG组HE×10;少量、分散、小面积炎症灶,渗出少,肺组织完整。图6 空质粒组HE×10;大量、大面积炎症灶,切片显微镜下有大量渗出物,2/3肺组织细胞破坏。图7 生理盐水组HE×10;大量、大面积炎症灶,切片显微镜下有大量渗出物,2/3肺组织细胞破坏。图8 空白对照组 HE×10;大量、大面积炎症灶,切片显微镜下有大量渗出物,2/3肺组织细胞破坏

6.肺菌负荷量(CFU)计数结果:Rpf D质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组和空白对照组比较差异有显著统计学意义(F值分别为22.3,40.2,35.8,28.7,P值均<0.01);Rpf E质粒组与 BCG组、空质粒组、生理盐水组和空白对照组比较差异有显著统计学意义(F值分别为19.5,36.7,32.8,30.0,P值均<0.01)(图9)。

图9 肺CFU计数直方图(各24只小鼠,CFU为平均数)

7.小鼠生存质量实验:各组的6只小鼠观察结果表明:对照组、生理盐水组、空质粒组在感染Mtb 3个月后出现行动缓慢、精神状态差、毛色无油脂、体质量减轻等症状。RpfD质粒组、RpfE质粒组、BCG组各方面与感染前没有太大变化。

讨 论

估计全球约1/3人口为Mtb潜伏感染者,其中约有5%~10%的人会在一生中的某个时间发展为活动性结核病[7]。新发TB患者主要来源于潜伏Mtb感染者,原因在于休眠 Mtb的再激活和复苏[8-9]。Bigger[10]指出休眠菌是一组休眠的、非复制的、对抗菌药物感觉迟钝的持留菌。因此对于结核病的控制,提高结核疫苗的预防保护效果势在必行,传统结核疫苗BCG的保护效率不佳,对Mtb再感染没有免疫保护作用[11]。Mtb复苏因子是与Mtb复苏有关的因子,一般认为复苏因子蛋白质产生的免疫效应在感知正在复苏的休眠Mtb中起着重要作用,同时复苏因子蛋白质也可能在正在复苏的休眠Mtb的宿主免疫调控中起着重要作用[12]。

笔者选择阳离子聚合物为佐剂与Rpf D、E质粒混匀构建DNA疫苗免疫小鼠3次,用H37Rv雾化感染小鼠,4周后处死小鼠检测感染小鼠免疫学指标及病理检测、细菌负荷计数等办法研究复苏因子疫苗的免疫保护作用。本研究结果表明,从肺外观察空质粒组、生理盐水组、空白对照组小鼠肺有大量的粟粒状结核病灶,且肺外观颜色灰白。而BCG和复苏因子D、E质粒组小鼠肺粟粒状结核病灶明显减少,特别是Rpf D、E两组,且颜色较为红润,表面光滑。小鼠肺组织CFU计数也表明空质粒组、生理盐水组、空白对照组、BCG组肺菌负荷量在105级,而Rpf D、E质粒组肺菌负荷量只在104级,差异有显著统计学意义(P<0.01),表明 Rpf D、E-DNA疫苗在抑制感染小鼠Mtb生长方面有明显的作用,BCG组有一定的抑菌作用。病理检测发现复苏因子免疫组和BCG免疫组为组织轻度炎症,而空质粒组、生理盐水组、对照组为组织中或重度炎症。Yeremeev等[1]报道复苏因子蛋白质疫苗在接种大剂量的毒力Mtb H37Rv小鼠中表现出明显的保护作用,在小鼠肺脏和脾脏中Mtb的繁殖和生存时间都受到抑制,与本研究的结果一致。

感染免疫小鼠血清复苏因子抗体及IFN-γ的检测表明:Rpf D、E质粒组抗体水平明显高于BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组(P<0.001)。Rpf D、E质粒组IFN-γ表达水平与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.001),与BCG疫苗组比较差异有统计学意义(P<0.05)。表明Rpf D、E质粒在感染小鼠体内启动了感染宿主的体液免疫。笔者在Rpf E-DNA疫苗对BALB/c小鼠免疫效应研究的试验中也得到了相应的结果。Yeremeev等[1]报道Rpf蛋白质疫苗在小鼠试验中有很高的免疫反应,除Rpf C外,均能诱导产生抗体IgG1和IgG2α、IFN-γ、IL-10、IL-12、促进 T细胞增殖,而不产生IL-4、IL-5。体液免疫和T细胞免疫显现出高度的交叉反应,与本研究的结果一致。

Romano等[13]的研究表明:对于 BABL/c小鼠,Rpf D、Rpf B能诱导结核感染小鼠脾淋巴细胞产生高水平的IFN-γ和IL-2;Commandeur[12]认为复苏因子A和D能诱导有Mtb暴露的健康人群产生高水平的细胞因子,而对结核患者Rpf D能诱导产生高水平的细胞因子,Rpf A诱导不产生或产生少量的细胞因子。Mtb感染疫苗免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖实验(CCK-8)结果显示:Rpf D、E质粒组也有较高的淋巴细胞增殖率,与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。通过上清细胞因子水平检测表明:IL-2、IFN-γ水平,RpfD、E质粒组与BCG免疫比较差异有统计学意义(P<0.05),与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义(P<0.001),而IL-12的表达差异没有统计学意义,并且都在低水平。本研究结果表明Rpf D、E疫苗能在感染小鼠体内产生很好的T细胞免疫,与Romano等[13]和 Commandeur[12]报道中的 Rpf B、Rpf D 疫苗对机体能产生很好的免疫保护作用一致。而Rpf D-DNA和Rpf E-DNA 疫苗结果各项指标间差异无统计学意义,表明 Rpf D-DNA 和 Rpf E-DNA疫苗对感染小鼠有同等的免疫效果。

本研究结果表明,复苏因子疫苗可增强Mtb感染小鼠的细胞免疫功能,并且能有效地减少肺组织菌负荷量,提高生存质量。笔者拟进一步建立小鼠潜伏感染模型并观察预防结核病“复燃”的效果,以期从另一角度研究新型的结核病预防性疫苗。

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