孙毅凡 李海成 周杰 钱明 陈涛 江勇 赖赛麟 江振友 钟球 周琳

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的。据报道，2010年全球结核病新增患者约有880万［1］。我国结核病年发病人数约为130万，占全球发病的14%，位居全球第2位［2］。我国结核病疫情仍很严重，因此围绕研发保护性疫苗、改进诊断技术一直是结核病基础研究的热点。

结核分枝杆菌能分泌大量的免疫原性蛋白，其中由Rv3803c基因编码的MPT51蛋白，与Ag85复合体有很大程度的同源性［3］，其可能作为有效的保护性抗原在结核分枝杆菌感染免疫中发挥重要作用。SodA由结核分枝杆菌Rv3846基因编码，是一种由致病性分枝杆菌大量分泌的毒力因子，可将宿主巨噬细胞产生的氧自由基转换为过氧化氢［4］，从而对抗巨噬细胞的氧化攻击。笔者克隆表达了Rv3803c、Rv3846基因，对其编码的蛋白 MPT51、SodA进行纯化鉴定，为进一步探讨相关分泌抗原的辅助诊断价值，构建保护性疫苗及筛选药物靶点等奠定实验基础。

材料和方法

一、菌种和载体

Mtb H37Rv标准菌株为本中心保存，大肠埃希菌（E．coli）TOP10菌株、E．coli Rosetta菌株购自中国Transgen公司，pGEX－6P－1载体（氨苄青霉素抗性，多克隆位点BamHⅠ，EcoRⅠ，SmaⅠ，SalⅠ，XhoⅠ，NotⅠ）购自美国GE公司。

二、酶和试剂

限制性内切酶、T4连接酶、Pyrobest DNA聚合酶均购自日本TaKaRa公司，谷胱甘肽巯基转移酶（anti－GST）鼠单抗购自美国Santa Cruse公司，辣根过氧化物酶（HRP）偶联的兔抗鼠二抗购自美国promega公 司，异 丙 基－β－D－硫 代 吡 喃 半 乳 糖 苷（IPTG）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、氨苄青霉素、还原性谷胱甘肽购自鼎国生物公司，Glutathione Sepharose 4B购自美国GE公司，电化学发光液（electrochemiluminescence，ECL）购自美国Pierce公司。

三、Rv3803c、Rv3846基因重组质粒的构建、表达和纯化方法

（一）基因克隆和鉴定