张 娟，蒋 俊，张 红，马龙凤，包 洪，于 庭＊

（1.沈阳市胸科医院，辽宁 沈阳110000；2.吉林大学第二医院，吉林 长春 130041）

近年来，随着耐药、耐多药结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的出现，使结核病死灰复燃，成为全球关注的公共卫生和社会问题，也因此使得结核病新型疫苗以及新型诊断试剂的研究具有重要意义。

多年来，人们一直将结核分枝杆菌培养滤液蛋白（culture filtrate proteins CFP）作为结核病预防和诊断试剂的抗原成分进行研究［1，2］。经过大量研究发现，Ag85复合物是MTB的主要分泌性蛋白抗原，占分泌蛋白总量的30%。而MPT64蛋白，是存在于MTB早期培养滤液中的一种主要分泌蛋白，占总量的8%，具有超氧化物歧化酶的活性［3］，并具有较强的细胞免疫活性，特异性强于纯化的结核菌素蛋白衍生物（purified protein derivative of tuberculin，PPD）。

我们根据Ag85蛋白和MPT64蛋白的特点，构建了Ag85A／MTP64核酸疫苗，通过真核表达，获得大量纯化的蛋白，并通过酶联免疫斑点（Enzymelinked Immunospot Assay，ELISPOT）技术对研究结果进行了验证，为进一步研究核酸疫苗在预防结核病中的作用奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料PCR系统含pfu Taq DNA聚合酶，dNTPs，buffer，MgCl2等购自上海生工公司；限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、BioLabs T4DNA连接酶试剂盒、DNA Marker购自TaKaRa公司；PCR产品纯化试剂盒购自Omega公司；胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自上海华瞬生物有限公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒、酵母提取物、胰化蛋白胨购自上海生工公司；琼脂糖购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 结核杆菌基因组DNA的提取 取少量结核菌H37Rv液接种于7H9液体培养基中，37℃培养两周。取3ml液体培养物12 000r·min－1离心1min，将沉淀重悬于50μl裂解液（10×PCR缓冲液5μl、45g·L－1吐温－20 5μl、45g·L－1NP-40 5μl、20g·L－1蛋白酶 K0.5μl及水34.5μl）中，55℃水浴1h，沸水浴10min灭活蛋白酶K，12 000 r·min－1离心1min。……