赵继学，王广义，张海玉＊，伏 鑫

（吉林大学1.第一医院a.儿外科；b.普外科，吉林 长春130021；2.中日联谊医院）

骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。由于其来源充足，取材相对方便，易于体外扩增，以及免疫原性低等优势，已经在组织工程和移植领域得到了广泛的关注。本实验旨在建立一种分离、培养、纯化及鉴定MSCs的方法，并对其生物学特性进行研究，为后续利用骨髓MSCs治疗肝脏疾病的研究提供稳定的干细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

清洁级昆明小鼠，雌雄兼用，体重25±2g，购自吉林大学实验动物中心［合格证号：SCXK（吉）2003－0001］；DMEM 培养基（美国GibcoBRL公司）；胎牛血清（美国Hyclone公司）；淋巴细胞分离液（上海恒信公司），0.25%胰蛋白酶（华美公司），兔抗鼠CD34、CD44荧光抗体（美国PHARMINGEN公司）。

1.2 方法

1.2.1 骨髓MSCs的体外分离、培养及扩增 断颈处死小鼠，超净台上取胫骨和股骨，切开两端松质骨，并在骨干中部剪断，无血清DMEM-LG培养基冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，经Percoll密度梯度离心法，分离和收集有核细胞，用含15%FBS的DMEM-LG培养基重悬离心管中的MSCs，镜下细胞计数，使细胞密度达到1×106个／ml，CO2培养箱培养，换液，将MSCs不断纯化。当细胞生长融合达80%－90%时，用1∶1的0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化分散细胞，在显微镜下控制消化时间，计数细胞，以1∶3密度扩增培养。此时标记为P1代，以后每3－4d换液1次；当细胞生长融合达80%－90%时，继续以1∶3的密度传代扩增培养，传代培养并记为P2代，余类推。倒置相差显微镜逐日观察细胞形态和生长情况。

1.2.2 骨髓MSCs生长曲线的绘制 取对数生长期的P1、P2、P3代 MSCs以1.0×105／ml密度分别接种在96孔培养板中，每3孔为一组，每孔100μl。……