李 莉，李 庆，乔路新，丁 渭，吕福东

（首都医科大学附属北京佑安医院，北京 100069）

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）是一种硫酸乙酰肝素糖蛋白（heparansulfate proteoglycan，HSPG），通过磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上［1，2］。其开放读码框为1 740bp，编码580个氨基酸的蛋白质前体。由于GPC3在肝细胞癌（HCC）中特异性高表达，而在正常肝或癌旁肝组织中不表达，可以作为肝细胞癌的临床诊断标志物，因此国内外学者对此进行了广泛研究［3－5］。目前认为GPC3可通过激活经典Wnt信号通路促进肝癌细胞的生长［6］，但具体机制仍然不清。本研究通过构建GPC3基因的真核表达载体，为研究GPC3在肝癌中的作用机制提供有力的工具。

1 材料和方法

1.1 材料表达载体pcDNA4.1、E.coliJM109菌株、E.coliDH5α菌株、人类肝脏cDNA文库由本实验室保存，HLE人肝癌细胞株由中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室赵晓航教授馈赠，兔抗人GPC3多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，质粒抽提纯化试剂盒和胶回收试剂盒为北京博迈德科技发展有限公司产品，LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，高保真DNA polymerase、DNA分子量标准、T4DNA连接酶、限制性内切酶（BamHⅠ、EcoRⅠ）、pMD-18simple T vector为 TaKaRa 公司产品，其他生化试剂：溴化乙啶（EB）、氨苄霉素、琼脂糖、乙醇、PBS等均为国产分析纯或进口分装试剂。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 GPC3基因的获得根据GenBank中查找的GPC3开放读码框（1 740bp）自行设计GPC3上、下游引物，并导入BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶酶切位点，序列如下：上游5′-CCG GGA TCC ATG GCC GGG ACC GTG CGC-3′（下划线处为 BamHⅠ酶切位点），下游5′-CCG GAA TTC TCA GTG CAC CAG GAA GAA G-3’（下划线处为EcoRⅠ酶切位点），以人类肝脏cDNA文库为模板进行PCR扩增目的基因，PCR扩增反应条件：94℃5min，94℃30s，65℃30s，72℃2min，72℃10min。扩增产物长度大小为1 740bp。取5μl反应产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳分析。……