郗红娟，靳 岚，王凤山，，郭学平

(1.山东大学 药学院 生化与生物技术药物研究所，山东 济南 250012;2.山东大学 国家糖工程技术研究中心，山东 济南 250100;3.山东省生物药物研究院，山东 济南 250108)

透明质酸(hyaluronic acid，HA)广泛存在于动物的各种组织间质中，不同来源的HA相互之间并无种属差异，而且对人及动物无抗原性［1］。HA是由相同的二糖单元重复排列而形成的无支链的直链高聚物，其中每个二糖单元由一个N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)以β-1，3糖苷键与葡萄糖醛酸(GlcA)组成，二糖单元间以β-1，4糖苷键连接。HA的相对分子质量(Mr)为106～107，HA经过降解可以得到HA寡糖(oligosaccharide of hyaluronic acid，o-HA)，Mr在 1 ×104以下，其性质与普通HA大不相同，甚至具有完全相反的作用［2］。研究表明，低MrHA片段和o-HA具有抗氧化［3］、调节免疫、抗炎、促进伤口愈合、促肿瘤血管生成［4］和抗肿瘤等活性。在逆转肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)方面o-HA和HA相比较具有明显的差异性，HA可以促进肿瘤的MDR，o-HA可以减弱HA与其受体的相互作用，增强耐药细胞对化疗药物的敏感性，能够抑制肿瘤细胞的抗凋亡途径并且抑制MDR运体的活性，进而抑制肿瘤MDR［5］。虽然国内外已经对HA的应用进行了广泛而深入的研究，但是对于o-HA生物活性的了解还处于初级阶段。

肿瘤细胞MDR是肿瘤细胞对不同结构和作用机制的化疗药物对其损伤的一种保护措施，是临床化疗治疗恶性肿瘤过程中影响疗效的最主要因素。肿瘤细胞MDR产生的机制极为复杂，包含多种可能的作用途径与方式，主要有:(1)依赖ATP外排泵的相关蛋白质的过度表达，其中研究较多的包括糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)以及MDR相关蛋白(multidrug resistant protein，MRP)的异常表达;(2)激活解毒系统，减少对药物的吸收;(3)存活途径的改变，如PI3K/Akt细胞存活途径(phosphatidylinositol 3-kinase-PI3K-/Akt)和凋亡途径及相关细胞凋亡基因的变化等。近年来有关于o-HA与肿瘤及其MDR的相关性的研究报道，o-HA可降低肿瘤化疗过程中的MDR。本文基于近年来发表的相关文献，对o-HA与肿瘤及其MDR相关性作一综述。

1 HA、o-HA与肿瘤

1.1 HA、o-HA在肿瘤中的作用

HA不仅是细胞外基质的重要的组成成分，而且可以通过与细胞表面相应受体的结合来促进正常细胞的游走和肿瘤细胞的侵袭。因此，在与肿瘤的相互作用中，HA在肿瘤转移侵袭等方面发挥着重要的作用。HA可高度水合，使细胞柔韧性增强，诱导细胞骨架的重组，促进细胞外形改变，提高组织渗透能力，HA为肿瘤细胞的入侵、转移提供通道。HA在辅助肿瘤转移中发挥作用是通过其受体蛋白CD44的参与来完成的，在CD44对HA的吸收和降解作用下，高MrHA有助于肿瘤细胞穿过基膜和细胞壁，最终完成自身的转移［6］。o-HA对不同的肿瘤有不同的作用，其机制也不一样［7］。Christian等［8］研究发现，o-HA(4 ～16 寡糖)能够诱导人和鼠的具有免疫作用的树突细胞的成熟，并促进树突细胞产生白介素、肿瘤坏死因子等细胞因子。o-HA(6～7寡糖)能够抑制多种肿瘤的生长，在体外它们抑制不依赖于贴壁的肿瘤细胞的增殖［9］。o-HA(4～6寡糖)能够促进基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)尤其是 MMP-9和MMP-13表达，促进肿瘤细胞的侵袭［10］。Mr为1 200～2 800的o-HA外源性地增加到胰腺癌细胞中，可大幅度地诱导CD44的裂解，而且已经证明该Mr的o-HA的在神经胶质瘤、乳腺癌、结肠癌和卵巢癌以及肺非小细胞癌中可以增加CD44 的裂解［11］。单一的 o-HA(o-HA4，o-HA6，o-HA8，o-HA10)可逆转耐阿霉素白血病细胞(K562/A02)耐药，增加阿霉素在耐药细胞内的蓄积，增强耐药细胞对药物的敏感性［12］。

1.2 HA受体与肿瘤MDR的相关性

HA在维持细胞外基质结构及调节细胞内活动方面都起着重要的作用，与HA相关的受体主要有CD44、细胞外基质金属蛋白诱导物(Emmprin，即CD147)、HA介导细胞游走受体(receptor for hyaluronan-mediated motility，RHAMM)和HA结合蛋白1(hyaluronan binding protein 1，HABP1)、TLR-4(Toll-like receptors 4)［13］等。HA与受体相互作用通过至少三个重要的生理学过程进行调节:信号转导、受体介导HA细胞内吞作用、细胞外基质的集合。每个阶段都需要多个受体共同完成。这些受体和HA参与细胞内信号的转导，并为组织内环境的稳定和细胞的运动提供条件。

CD44是一类跨膜糖蛋白，是细胞表面HA最重要的受体。CD44调节细胞的聚集、增殖、迁移和肿瘤血管发生。HA与胞内结构之间的联系是通过CD44受体胞内部分与细胞骨架蛋白的相互作用来实现的［14］。因此，调节HA-CD44相互作用可以治疗恶性肿瘤及对抗MDR中发挥重要的作用。4-甲基繖形酮(4-MU)是HA合成物的抑制剂，在体内外实验均可降低乳腺癌耐药细胞(JIMT-1)中HA的水平，使曲妥抗体与ErbB2的结合提高，增强ErbB2的衰减调节。经4-MU处理的曲妥抗体对JIMT-1生长的抑制作用增强，揭示了HA-CD44途径在针对肿瘤细胞受体靶向治疗中的重要作用［15］。o-HA(3-9个双糖单元)结合单价的CD44可以取代HA多聚体与膜受体结合，并抑制 HA的合成［16］，o-HA或CD44单抗能与CD44结合并阻止它启动可能导致药物抗性的信号级联，从而部分逆转耐药。由于CD44对细胞周期蛋白D1信号途径的调节，导致配基-受体系统通过对不同信号途径中细胞周期靶点的调节，进而对有丝分裂产生不同的作用。因此，不同Mr的HA与CD44的结合可以对细胞的周期进展和增殖产生不同的影响［17］。

Emmprin是一种细胞表面免疫超基因家族糖蛋白，可以刺激HA的表达并调节下游区域信号。在多种恶性肿瘤系中Emmprin和CD44局部联合[18]，HA、CD44和 Emmprin之间的相互作用已被证实可以在不同水平上影响肿瘤细胞对药物的耐药性，例如，在细胞生存信号通路及药物转运体的表达和活性调节等方面，促成肿瘤细胞的糖酵解［19］;在HA介导下，Emmprin可以诱导人恶性肿瘤细胞中MMP的产生［14］，并且HA-Emmprin相互作用可以影响肿瘤细胞的耐药性和ErbB2的激活［19］。Emmprin同时也可以与各种单价羧酸盐转运体(monocarboxylate transporters，MCT)相互作用，MCT转运由糖酵解产生的乳酸盐，恶性肿瘤细胞则利用糖酵解途径和乳酸盐分泌导致肿瘤MDR。CD44和Emmprin在恶性乳腺癌细胞膜上与MCT1、MCT4相互作用。o-HA可以干扰质膜HA-CD44相互作用，并下调Emmprin，使MCT1、MCT4的合成和聚集受到抑制，最终抑制乳酸盐的外排［19］。

RHAMM是HA的结合蛋白，已经被证明在恶性细胞的转移和侵袭中具有重要的作用。RHAMM和CD44在细胞信号转导中有不同的作用，RHAMM和CD44在细胞信号转导中有不同的作用，例如CD44可以调节细胞增殖，而RHAMM则调节细胞转移［14］。RHAMM在急慢性髓性白血病、结肠癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌和乳腺癌等多种肿瘤细胞内都有表达，并且RHAMM的表达可以促进肿瘤细胞的浸润和转移［20］。RHAMM表达水平的升高与肿瘤的侵袭参数呈正向相关，可作为临床检测和疗效的候选指标，为肿瘤的诊断和治疗提供参考。RHAMM在细胞表面结合HA，同时可以激活蛋白(质)酪氨酸激酶、成簇黏附激酶、细胞外信号调节激酶，从而促进肿瘤的转移。

HABP1(hyaluronan binding protein 1)是HA黏素家族中的一员，能够特异性地与HA结合。用抗HABP1的单抗对甲状腺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、食管癌以及肺腺癌组织进行免疫组化染色，与它们各自的非恶变组织进行对照，结果显示，HABP1在这些癌组织中呈高表达;相反，在肾癌、子宫内膜癌和前列腺癌中却没有这种表达差异。在HABP1高表达的肿瘤中的HA含量也是升高的，说明HA与HABP1间的相互作用可能与肿瘤的发生发展有关［21］。

TLR是自身免疫系统重要的调节受体。HA与TLR-4相互作用促进NF-kB的表达，从而使MMP-2表达量增多，促进肿瘤细胞的侵袭，HA可以作为研究肿瘤和免疫机制的关系的受体［22］。不同的TLR受体可能对不同的长度的HA片段有不同的应答反应，TLR-4是o-HA(4～6个二糖单元)的受体，在黑色素瘤细胞中o-HA部分依赖TLR-4并通过诱导MMP和细胞因子的表达促进肿瘤细胞的侵袭［9］，HA片段可以在损伤位点刺激炎症因子基因的表达，在炎症细胞中HA片段信号通过TLR-4、TLR-2和CD44结合刺激炎性基因，HA和HA结合蛋白通过炎症细胞的募集、炎性因子的释放和细胞的转移调节炎症及对组织损伤的修复。

2 o-HA可以抑制MDR

肿瘤细胞MDR是肿瘤细胞对不同结构和作用机制的化疗药物对其损伤的一种保护措施，是临床化疗治疗恶性肿瘤过程中影响疗效的最主要因素。肿瘤细胞MDR产生的机制极为复杂，包含多种可能的作用途径与方式。近几年，HA与受体之间的相互作用已被证实可以在不同水平上影响肿瘤细胞对药物的耐药性，例如，对不同肿瘤细胞系间的差异性影响，调节细胞生存信号通路，调节药物转运体的表达和活性，以及糖酵解的表达等。近年来研究较多的包括MDR1基因编码的药物转运泵糖蛋白P-gp以及MRP的表达异常，信号传导通路PI3K/Akt中与细胞调亡和抑制有关的基因对MDR的影响也开始受到关注。

2.1 o-HA通过抑制PI3K/Akt细胞存活途径来抑制MDR

细胞生存途径/抗凋亡途径水平的提高是肿瘤细胞中常有的现象，是主要的促抗药性的因素。PI3K/Akt细胞存活途径会影响细胞的多种生物学活性，主要包括细胞的增殖、存活和凋亡、血管生成和肿瘤细胞的侵袭与转移以及MDR。PI3K/Akt是抗细胞凋亡途径，在许多恶性肿瘤细胞中表达上调，受体酪氨酸激酶可以调节其活性，可增加ABC家族转运体的表达，如P-gp蛋白和BCRP等［23］。在体外实验中，HA利用PI3K依赖机制，通过激活T淋巴瘤侵袭转移(T-lymphoma invasion and metastasis，Tiam1)诱导多药耐药淋巴细胞系的转移［5］。o-HA对HA的干扰作用可以抑制肿瘤生长和转移以及敏化抗有丝分裂的癌细胞［24］。Ghatak等［25］研究表明，o-HA通过促进肿瘤抑制基因(PTEN)的表达，抑制PI3K/Akt信号传导通路而抑制肿瘤细胞。NF-kB(nuclear factor-kB)和PI3K/Akt细胞存活途径都可以抑制细胞凋亡，在淋巴癌细胞系中用o-HA和渥曼青霉素抑制PI3K来降低Akt的磷酸化水平逆转耐药，却不能抑制NF-kB的活性，作用机制与天然的HA不同［26］。o-HA通过调节P-gp和PI3K/Akt细胞存活途径的活性使耐长春新碱淋巴瘤细胞的敏感性增强，可与经典的化学疗法联合治疗耐药的恶性肿瘤。o-HA还可以抑制HA-CD44的相互作用进而导致ErbB2活性的降低，从而降低PI3K/Akt细胞存活途径的活性和其他信号途径的衰减(如有丝分裂原激活蛋白酶和成簇黏附激酶途径)［27］。

2.2 o-HA通过抑制MRP的表达来抑制MDR

HA-CD44与蛋白激酶C相互作用通过促进干细胞标记物nanog和微小-RNA21的产物促进致癌信号的产生，导致了肿瘤抑制蛋白表达的下调，以及凋亡抑制剂和MRP表达的上调［28］。在神经胶质瘤细胞中，HA-CD44的相互作用可以调节ABC家族药物转运体如P-gp蛋白和BCRP等的表达［29］，诱导联接蛋白结合Pgp导致化疗药物的外排和化药耐药性。HA-CD44对胞浆膜的转运体具有局部化稳定作用，CD44可以在肿瘤细胞质膜中与P-gp蛋白和BCRP局部联合，两者可以协同促进肿瘤细胞的侵袭［30］，例如，Pgp与CD44相互作用促进乳腺癌和黑色素瘤细胞增值和入侵［5］。用o-HA可以减弱HA-CD44的相互作用，可以引起CD44转运体的降解和诱导CD44、BCRP和Pgp的细胞内摄作用，敏化阿霉素对恶性外周神经鞘瘤(malignant peripheral nerve sheath tumors，MPNST)的治疗［29］，因此 o-HA 可以抑制药物转运体的活性和提高MPNST对阿霉素治疗的敏感性［31］，同时抑制Pgp底物钙离子荧光探针(FURA 2-AM)的外排及HA的分泌。如果对肿瘤细胞采用肌动蛋白聚合物的抑制剂进行联合治疗，那么o-HA诱导的CD44和转运体的内吞作用将被抑制［18］。o-HA和CD44单抗的干预均能够降低耐顺铂的肺癌细胞(A549/DDP)中HA的表达，经过处理的耐药细胞的各种耐药蛋白的表达率明显降低，表明o-HA或CD44单抗可能是通过抑制MDR蛋白的表达来逆转肿瘤对顺铂类药物的耐药［32］。

2.3 o-HA通过诱导凋亡调控蛋白的表达来抑制MDR

bcl-2和p53均为凋亡调控蛋白，bcl-2抑制肿瘤细胞的凋亡，而p53可以促进肿瘤细胞的凋亡。因此，p53表达上调或bcl-2下调均能促进肿瘤细胞凋亡而达到一定程度逆转耐药的作用。在敲除CD44的小鼠模型中，结肠上皮细胞表现出凋亡水平提高，通过线粒体途径伴随着caspases3和9的激活，Bcl-xl表达的降低，细胞周期调节器的废除，以及线粒体嵴的破裂。相反的，CD44的过表达可抑制耐药细胞凋亡［14］。o-HA的干预能增强耐阿霉素乳腺癌细胞(MCF-7/ADM)对化疗药ADM的敏感性，使ADM对耐药细胞的杀伤性增强，并可增加胞内化疗药物的浓度以逆转MCF-7/ADM细胞的耐药性。经过处理后的耐药细胞，耐药蛋白P-gp和MRP的表达率明显降低，p53表达上调，表明o-HA可能通过抑制MDR蛋白的表达以及调控凋亡蛋白来逆转细胞对ADM 的耐药［33］。

3 展望

临床应用的HA拮抗剂，如o-HA或CD44单抗能够部分逆转癌细胞药物抗性，o-HA无毒副作用、无免疫抗原，更能显示其临床应用的优越性，体外细胞实验证明，o-HA具有开发成肿瘤MDR抑制剂的前景。深入研究o-HA的抗肿瘤活性及其在逆转肿瘤细胞MDR方面可能发挥的作用途径与方式，将为进一步了解o-HA抑制肿瘤细胞及其逆转MDR的作用提供良好的理论基础。

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