韩瑞梅，李南方，严治涛，郭艳英，张菊红，王红梅，洪 静，周 玲

1新疆医科大学 研究生院，乌鲁木齐 830054

2新疆维吾尔自治区人民医院高血压诊疗研究中心 新疆高血压诊疗研究中心，乌鲁木齐 830000

前列腺六次跨膜蛋白-2(six transmembrance protein of prostate 2，STAMP2)(又称为肿瘤坏死因子诱导的脂肪相关蛋白或者前列腺六次跨膜上皮抗原-4)属于前列腺六次跨膜上皮抗原家族成员之一［1］，在内脏脂肪组织高度表达，存在于脂肪细胞的跨膜蛋白，在脂肪形成重塑时其以剂量-时间依赖模式被肿瘤坏死因子-α 诱导［2］。Wellen 等［3］发现在维持脂肪细胞功能和全身代谢过程中，STAMP2联系着炎症和饮食因素，STAMP2的表达对于胰岛素信号通路是必需的。STAMP2基因敲除鼠在正常饮食条件下，自发的发生代谢性疾病，表现为葡萄糖耐量降低、脂质异常、脂肪肝和炎症与氧化应激，STAMP2基因随脂肪细胞分化成熟表达逐渐下调，可促进脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚，与肥胖和胰岛素抵抗的发生有关。Arner等［4］报道人脂肪组织中STAMP2的表达与胰岛素抵抗和肥胖有关。因此，从功能上可以说STAMP2基因是2型糖尿病的候选基因。目前，关于STAMP2基因多态性与维吾尔族糖尿病的关联研究报道较少，因此，本研究通过测序法筛查STAMP2基因变异位点，在确定基因代表性变异位点的基础上，应用TaqMan-PCR技术在维吾尔族自然人群中进行基因分型，分析其与维吾尔族糖尿病的相关性，从遗传学角度探讨糖尿病和胰岛素抵抗的易感机制，以期为今后糖尿病的防治奠定一定的遗传学基础。

对象和方法

对象 1838例来自2007年1至2月新疆和田地区维吾尔族人肥胖、高血压、糖尿病、血脂紊乱的横断面调查研究人群［5］，其中男性694例、女性1144例，年龄 (51.2±10.7)岁。所有受试者均生活在相对隔离地区，3代无异族通婚及近亲结婚。根据1999年中华医学会糖尿病学会制订的2型糖尿病诊断标准建议，将研究对象分为2组，糖尿病组:274例，男性114例、女性160例，空腹血糖≥7.0 mmol/L或随机血糖≥11.0 mmol/L或既往已经诊断为糖尿病的患者;对照组:1564例，男性580例、女性984例，空腹血糖≤5.6 mmol/L且随机血糖或餐后2 h血糖≤7.8 mmol/L的个体为对照。同时排除正在服用降糖或影响血糖水平药物的病例，以及继发性高血压、恶性肿瘤、服用避孕药者、肝肾疾病及甲状腺疾病者，以上两组资料性别比例匹配。本研究经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会批准，研究对象均取得知情同意。

方法 体格检查及生化检测测定身高、体重、腹围、血压等。在受试者知情并同意的情况下，空腹自肘静脉抽取静脉血10 ml，离心处理，－70℃保存。葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖 (fasting blood glucose，FBG)，放射免疫法测定空腹血胰岛素 (fasting insulin，FINS)，稳态模型评估法 (homeostasis model of assessment，HOMA)计算胰岛素抵抗 (insulin resistance，IR)指数 (HOMA-IR=FBG×FINS/22.5)，β细胞功能指数 (HOMA-B)以HOMA-B=20×FINS/(FBG-3.5)评估。

基因组DNA提取 所有被调查者留取血细胞5 ml，应用试剂盒 (PAXgene blood DNA kit，A QIAGEN/BD Company)提取人血白细胞DNA，使用分光光度仪(贝克曼公司，美国)测定DNA浓度及纯度，DNA溶于缓冲溶液－80℃冻存备用。

STAMP2基因筛查及代表性位点的基因型鉴定 选取48例 (男性24例、女性24例)无亲缘关系的维吾尔族糖尿病患者样本，对STAMP2基因的所有外显子、外显子-内含子交界区、5’和3’非编码区～1kb序列进行PCR扩增及测序分析 (BigDye3.1测序试剂，加利福尼亚，美国)，以NT_007933.14为参考核酸序列。从测序发现的变异中，考虑可能的功能 (错义突变)和连锁不平衡关系 (r2＞0.8)后选择最小等位基因频率 (minor allele frequency，MAF)＞5%的常见变异位点和低频率的错义突变，应用TaqMan-PCR(ABI PRISM 7900HT，UK)技术在大样本自然人群中进行基因型鉴定。引物及探针由美国ABI公司设计并合成。PCR反应体系:Master Mix 2.25 μl，引物 0.125 μl，DAN 1.0 μl，加去离子水至5 μl。PCR反应条件:95℃预变性10 min，43个循环 (95℃变性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min)，最后72℃延伸7 min。

统计学处理 采用SPSS 16.0软件包进行统计学分析，定量资料根据是否正态分布用均数±标准差或中位数及均数的95%可信区间表示，组间一般资料的比较采用t检验及χ2检验;组间基因型频率分布采用χ2检验。Hardy-Weinberg平衡检验及连锁不平衡用SNPAlyze 7.0专业版 (DYNACOM Co.Ltd.，Mobara，Japan)软件完成;采用多元线性回归控制年龄、性别、吸烟和饮酒影响后比较不同基因型间血糖水平、胰岛素、HOMA指数等指标。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

临床资料比较 糖尿病组和对照组年龄、体重指数、腹围、血压及饮酒差异具有统计学意义 (P＜0.05)，但性别比例和吸烟差异无统计学意义 (P＞0.05)(表1)。

STAMP2基因功能区测序结果 48例维吾尔族糖尿病患者中STAMP2基因功能区测序共发现16个变异位点，内含子区7个，外显子区3个，3'非翻译区6个 (表2)。6个单核苷酸多态性在NCBI的SNP数据库中已有记录，10个变异位点为此次研究新发现。在最小等位基因频率＞5%的8个常见变异中，根据连锁不平衡关系 (r2＞0.8)选取7414G/A(rs8122)、224A/G(rs1981529、Gly75Asp)、364G/A(rs34741656、Ala122Thr)和6031T/G(新发现)作为代表性变异位点，其中6031T/G(新发现)分型失败。

STAMP2基因代表性变异基因型频率的分布STAMP2基因的3个变异位点在各组的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律 (P＞0.05)。在总人群中，rs8122位点基因型频率在对照组与糖尿病组间的差异具有统计学意义 (P=0.05)，而在总体及按性别分层中，rs1981529和rs34741656位点基因型分布频率的差异无统计学意义 (P＞0.05)(表3)。

STAMP2基因rs8122变异不同基因型组间糖尿病表型资料 在总人群中不同基因型组间空腹胰岛素及在女性不同基因型组间HOMA指数差异具有统计学意义 (P＜0.05)，但在校正P值后差异无统计学意义 (P＞0.05)。在男性人群中，STAMP2基因rs8122变异不同基因型组间各项指标差异无统计学意义 (P＞0.05)(表4)。

STAMP2基因多态位点单体型分析 3个常见变异位点rs8122、rs1981529和rs34741656共构建了6个单体型，其中频率＞9%的4个常见单体型解释了糖尿病组所有单体型99.57%的作用，两组间各单体型构成比的差异无统计学意义 (P=0.216)(表5)。

表1 临床资料在对照组和T2DM组间的比较Table 1 Basic characteristics of subjects in T2DM group and control group

表2 48例维吾尔族糖尿病患者STAMP2基因功能区测序结果Table 2 Identified polymorphisms of the STAMP2 gene in 48 Uygur subjects with T2DM

表3 STAMP2基因rs1981529、rs34741656、rs8122变异在T2DM组和对照组中的基因型频率分布(%)Table 3 Genotype distributions of rs1981529，rs34741656，and rs8122 polymorphism in T2DM group and control group(%)

讨 论

STAMP2是一种肿瘤坏死因子-α诱导的脂肪组织相关蛋白，受多种细胞因子调节［6-8］，与代谢性疾病密切相关［3］。前列腺六次跨膜上皮抗原-4基因敲除动物内脏脂肪组织中炎症因子表达明显增高，机体表现出明显的炎症反应和氧化应激改变，进一步导致胰岛素抵抗、葡萄糖代谢障碍等一系列代谢障碍［3］。为此，本研究观察了STAMP2基因变异与糖尿病的关系，以探讨糖尿病、胰岛素抵抗的发病机制。

本研究共筛查出16个STAMP2基因的变异位点，其中10个位点首次发现，一定程度上证实了STAMP2基因种族特异性，不同民族具有特异的突变位点。本研究选择3个代表性SNP在研究人群中进行基因型鉴定并进行病例-对照关联研究，在总人群中，rs8122位点基因型频率在对照组与糖尿病组间的差异为“临界”，为进一步探讨rs8122变异与糖尿病的关系，比较了rs8122变异不同基因型组间糖尿病的相关表型资料 (空腹血糖、2h血糖、空腹胰岛素、HOMA指数、HOMA-B)，发现在总人群中不同基因型组间空腹胰岛素及在女性不同基因型组间HOMA指数差异具有统计学意义，但在校正P值后差异无统计学意义。通过不同角度、不同层面的分析，反映了STAMP2基因rs8122、rs1981529和rs34741656变异与维吾尔族糖尿病不相关。

表4 糖尿病相关数量性状在STAMP2基因rs8122不同基因型间的比较Table 4 Comparison of diabetes quantitative phenotypes among rs8122 genotypes of STAMP2 polymorphisms in Uygur population

表5 T2DM组和对照组STAMP2基因单体型频率比较Table 5 Comparison of haplotype frequency of STAMP2 polymorphism between T2DM group and control group

本研究首次在小样本新疆维吾尔糖尿病人群中筛查STAMP2基因功能区的所有变异位点，选择代表性变异位点在大样本人群中进行基因型鉴定而开展的病例-对照研究。本研究采用这种研究策略主要基于以下几点:(1)研究人群为新疆维吾尔族，为糖尿病高发民族，而NCBI数据库中无维吾尔族相关遗传信息，如果按照数据库中其他民族的信息选取SNP，必定会存在误差，同时会错失该民族某些特异性位点的发现，以便发现该民族特异性、新的变异位点。(2)小样本筛查变异，大样本验证的关联研究，相对于大样本测序研究可以大大节省研究费用。选取新疆维吾尔族人群中开展此项研究主要是由于:(1)既往的流行病学调查显示，新疆维吾尔族是代谢性疾病的高发民族，明显高于同地区的其他民族［5，9-10］，同时有研究报道该民族胰岛素抵抗的发病率非常高［11］;(2)由于文化、宗教、地域、经济等原因，本研究选择的和田地区维吾尔族仍保留有大量相对完整的隔离遗传体系，并且人口相对稳定，是遗传研究宝贵的资源。本研究在小样本糖尿病人群中共筛查发现16个变异位点，其中6个SNPs在NCBI的SNP数据库中已有记录，10个变异位点为此次研究新发现，为该民族在STAMP2基因遗传数据库提供了更多信息。

本研究尚存在局限性，即未在相同民族的正常人群中进行基因测序分析，且本研究的样本量仍不足以显著区分中度效应的STAMP2基因多态位点，因此应该进一步在其他人群或更大样本量中重复验证该研究结果。基因组扫描连锁分析显示，7号染色体长臂是2型糖尿病、胰岛素抵抗等的易感区［12-14］，因此，有必要扩展STAMP2基因区域进一步研究基因多态性与糖尿病、胰岛素抵抗的关系。

综上，本研究通过对STAMP2基因功能区测序筛选维吾尔族糖尿病患者特异的变异位点进行人群关联研究分析，报道了STAMP2基因rs8122、rs1981529及rs34741656位点多态性与新疆维吾尔族糖尿病之间的关联研究，研究未显示STAMP2多态性与新疆维吾尔族糖尿病相关，但结果尚待进一步在大样本、不同种族人群中进行验证。

［1］Ohgami RS，Campagna DR，McDonald A，et al.The steap proteins are metalloreductases［J］.Blood，2006，108(4):1388-1394.

［2］Moldes M，Lasnier F，Gauthereau X，et al.Tumor necrosis factor-alpha-induced adipose-related protein(TIARP)，a cell-surface protein that is highly induced by tumor necrosis factor-alpha and adipose conversion［J］.J Biol Chem，2001，276(36):33938-33946.

［3］Wellen KE，Fucho R，Gregor MF，et al.Coordinated regulation of nutrient and inflammatory responses by STAMP2 is essential for metabolic homeostasis［J］.Cell，2007，129(3):537-548.

［4］Arner P，Stenson BM，Dungner E，et al.Expression of six transmembrane protein of prostate 2 in human adipose tissue associates with adiposity and insulin resistance［J］.J Clin Endocrinol Metab，2008，93(6):2249-2254.

［5］Li NF，Wang HM，Yang J，et al.Serum uric acid is associated with metabolic risk factors for cardiovascular disease in the Uygur population［J］.Appl Physiol Nutr Metab，2009，34(6):1032-1039.

［6］Fasshauer M，Klein J，Krahlisch S，et al.GH is a positive regulator of tumor necrosis factor alpha-induced adipose related protein in 3T3-L1 adipocytes［J］.J Endocrinol，2003，178(3):523-531.

［7］Fasshauer M，Kralisch S，Klier M，et al.Interleukin-6 is a positive regulator of tumor necrosis factor alpha-induced adipose-related protein in 3T3-L1 adipocytes［J］.FEBS Lett，2004，560(1-3):153-157.

［8］Kralisch S，Sommer G，Weise S，et al.Interleukin-1beta is a positive regulator of TIARP/STAMP2 gene and protein expression in adipocytes in vitro［J］.FEBS Lett，2009，583(7):1196-1200.

［9］郭艳英，王坤，赵雷，等.新疆博尔塔拉蒙古自治州维、哈、蒙、汉四民族代谢综合征流行病学调查 ［J］.中华内科杂志，2006，45(3):227-228.

［10］祁燕，谢自敬，阿不力克木.乌鲁木齐市维吾尔族成年人代谢综合征流行病学调查 ［J］.中国现代医学杂志，2004，14(19):155-156.

［11］王薇彬，李云，谢自敬，等.乌鲁木齐市维吾尔族居民1002人糖、脂代谢紊乱与胰岛素抵抗的关系 ［J］.中国临床康复，2004，8(33):7418-7419.

［12］Hanson RL，Ehm MG，Pettitt DJ，et al.An autosomal genomic scan for loci linked to typeⅡdiabetes mellitus and body-mass index in Pima India ［J］.Am J Hum Genet，1998，63(4):1130-1138.

［13］Cheng LS，Davis RC，Raffel LJ，et al.Coincident linkage of fasting plasma insulin and blood pressure to chromosome 7q in hypertensive Hispanic families ［J］.Circulation，2001，104(11):1255-1260.

［14］Manolio TA，Brooks LD，Collins FS.A hapmap harvest of insights into the genetics of common disease［J］.J Clin Invest，2008，118(5):1590-1605.