黄春燕，赵艳琼，邝晓聪

(1广西医科大学研究生学院，南宁 530021;2广西医科大学公共卫生学院;3广西医科大学基础医学院病理生理学教研室)

巨噬细胞激活是炎症反应的重要环节，在巨噬细胞过度激活下可产生各种炎性介质如TNF-α，IL-1β，引发炎症反应，导致组织损伤。内毒素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7广泛用于炎症反应的研究。近期我们观察了乌司他丁对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞炎症反应的影响，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM培养基(Gibco公司)，LPS(美国Sigma公司);Trizol提取试剂盒(美国Invitrogen公司);实时荧光定量逆转录聚合酶链反应试剂盒(日本Toyobo公司);ELISA试剂盒(Biosource International公司);乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司)。小鼠巨噬细胞株RAW264.7(美国ATCC公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及处理 将RAW264.7细胞置于95%空气、5%CO2培养箱中，用含10%胎牛血清、1%双抗(青霉素+链霉素)的DMEM培养基中培养。将培养细胞按1×104/孔接种于96孔板中，分为三组。细胞贴壁4 h后空白对照组予生理盐水处理;LPS组予1.0 μg/mL的 LPS处理;乌司他丁组予LPS处理(浓度同上)并分别予100、1 000、5 000和10 000 U/mL的乌司他丁处理(各浓度均为3孔)，孵育24 h。

1.2.2 观察项目 ①细胞活性:细胞孵育24 h后PBS洗2次，每孔加入 MTT(5 mg/mL)10 μL，继续孵育4 h后弃上清，每孔加入DMSO，震荡10 min，于570 nm波长处测定乌司他丁各浓度组及对照组吸光度值(OD值)。② 促炎因子表达:细胞干预后继续孵育 2 h，再加入1.0 μg/mL 的 LPS 刺激24 h，采用ELISA法测定TNF-α、IL-1β蛋白水平(均严格按照试剂说明书进行，用试剂盒提供的标准曲线计算);采用 qRT-PCR法测定 TNF-α mRNA和 IL-1β mRNA表达(TNF-α上游引物:5'-GCA CAG CCT TCCTCA CAG AG-3'，下游引物:5'-ACC CGT AGG GCG ATT ACA GT-3';IL-1β上游引物:5'-GCT GTT CCC TTG ACC CAG AC-3'，下游引物:5'-GGT GAT AAC GGT GGC CTG AC-3';β-actin(内参照):上游引物 5'-CATCCGTAAAGCCTCTATGCCAAC-3'，下游引物 5'-ATGGAGCCACCGATCCA CA-3'。总 RNA抽提按Trizol抽提试剂说明书进行，逆转录按ReverTraAce®qRT-PCR试剂盒说明进行，PCR反应用SYBR® Green Realtime PCR Master分析，数据分析用StepOne Real-Time PCR系统。mRNA的相对定量采用 2－ΔΔCt法计算，ΔΔCt=(Ct靶基因 － Ct内参)处理组－(Ct靶基因－Ct内参)未处理组。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件行统计学处理。实验数据采用±s表示，组间比较用方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 细胞活性 乌司他丁组及对照组细胞活性比较见表1。与对照组比较，乌司他丁100～10 000 U/mL浓度范围内细胞活性差异均无显著性，表明乌司他丁对小鼠巨噬细胞株RAW264.7无明显毒性。

表1 乌司他丁各浓度组及对照组细胞活性比较(OD 值，n=3， ±s)

表1 乌司他丁各浓度组及对照组细胞活性比较(OD 值，n=3， ±s)

注:乌司他丁各浓度组与对照组比较，P均＞0.05

组别 细胞活性乌司他丁组100 U/mL 96.2 ±7.6 1 000 U/mL 95.2 ±6.6 5 000 U/mL 92.6 ±7.2 10 000 U/mL 92.4 ±5.2对照组96.8 ±3.2

2.2 促炎因子表达 各组促炎因子表达 见表2。

表2 各组促炎因子表达比较(n=3，μmol/L，±s)

表2 各组促炎因子表达比较(n=3，μmol/L，±s)

注:与对照组比较，#P ＜0.001;与 LPS组比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01，●P ＜0.001

组别 TNF-α IL-1β LPS 组 486.8 ±52.6# 90.1 ±15.2#乌司他丁组100 U/mL 419.3 ±76.1 82.1 ±20.2 1 000 U/mL 232.1 ±46.9△ 46.1 ±12.3*5 000 U/mL 215.8 ±38.5△ 38.6 ± 8.1△10 000 U/mL 112.6 ±20.9● 21.8 ±10.1△对照组5.8 ± 1.6 5.6 ± 1.2

3 讨论

研究证实，巨噬细胞是炎性细胞中的重要组成部分，在炎症性疾病中起重要作用。Keitn［1］等发现子痫前期患者体内巨噬细胞大量增殖，并分泌各种生物活性物质如TNF-a，导致炎症级联反应，广泛内皮细胞损伤，血管通透性增加，全身小血管痉挛，引发血压升高及蛋白尿。Faas［2］通过向妊娠大鼠静脉注射内毒素造成炎性反应被过度激活，并成功建立了妊娠期高血压疾病动物模型，表明过度炎症反应激活可能导致子痫前期的发生。Chen等发现子痫前期患者白细胞分泌TNF-α mRNA明显增多，表明TNF-α参与了子痫前期炎症反应的发生。有研究表明IL-1β在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中含量显著升高［3］，IL-1β 可诱导内皮细胞黏附分子VCAM-1的表达，激活内皮细胞，参与内皮细胞损伤过程［4］。本研究对照组 TNF-α、IL-1β 及其 mRNA表达极低，LPS组表达显著增加。表明LPS能够诱导巨噬细胞过度激活，释放系列炎症介质。

乌司他丁是一种典型的Kuniz型蛋白酶抑制剂，通过抑制多种酶的活性、稳定溶酶体膜及抑制炎症介质的释放而发挥作用。有报道，乌司他丁可抑制体外LPS诱导的促炎因子的过量产生［5］，与本研究结果一致。Kanayama等［6］发现，乌司他丁能预防因感染产生炎症因子(如IL-8)引发的宫内炎症，延长孕周，预防早产。本研究结果显示，乌司他丁1 000～10 000 U/mL浓度范围内能剂量依赖性的抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞释放 TNF-α、IL-1β及其mRNA表达，与上述研究结果一致。提示乌司他丁可从细胞因子和转录水平上抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌促炎因子，且该作用与乌司他丁的浓度有关。

总之，乌司他丁对巨噬细胞分泌的炎症因子TNF-α、IL-1β具有负性调节作用，此可能为其抑制过度炎症反应发生的主要机制。鉴于巨噬细胞及其分泌的炎性介质在子痫前期发病中所起的重要作用，推测乌司他丁可从抑制炎症反应方面为子痫前期的防治提供新的思路。

［1］Keitn JC Jr，Pijnenborg R，Luyten C，et al.Maternal serum levels of macrophage colony stimulating factor are associated with adverse pregnancy outcome［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2000，89(1):19-25.

［2］Faas MM，Schuiling GA，Baller JF，et al.A new animal model for human preeclampsia:ultra-low-dose endotoxin infusion in pregnant rats［J］.Am J Obst Gyecol，1994，171(1):158-164.

［3］朱玉莲，康睿，赵艳玉，等.IL-1β在妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中的表达研究［J］.医学临床研究，2006，23(6):943-944.

［4］赵宏喜，姚元庆，李东红，等.白介素-1β在妊娠期高血压疾病中的作用［J］.第三军医大学学报，2005，27(6):557-559.

［5］Inoue K，Takano H，Sato H，et al.Protective role of urinary trypsin inhibitor in lung expression of proinflammatory cytokines accompanied by lethal liver injury in mice［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2009，31(3):446-450.

［6］Kanayama N，Maradny E，HalimA，et al.Urinary trypsin inhibitor suppresses premature cervical ripening［J］.J Obstet Gynecol Reprod Biol，1995，60(2):181-186.