华秀峰 ，王延伟，刘芙君，靳少华，孟晓梅，李华峰，王海燕，李建远

(1烟台毓璜顶医院，山东烟台 264000)

流行病学调查显示，近年来我国糖尿病患病率逐渐升高［1］。1型糖尿病需终生胰岛素治疗，50%以上的2型糖尿病患者患病5年后需行胰岛素治疗，但外源性胰岛素疗效并不十分理想。近年来胰岛移植治疗糖尿病获得成功［2］，但需两个尸体胰腺方能满足一次胰岛移植所需的细胞量，巨大的社会需求与尸源性胰岛供体不足迫切要求临床探寻新的胰岛细胞来源。胚胎干细胞(ESs)来源于早期胚胎内细胞团，是真正的全能干细胞，可发育成包含内胚层、中胚层及外胚层在内的所有类型的组织器官，通过体外定向诱导，小鼠及人ESs已成功分化为胰岛素分泌细胞［3，4］，为糖尿病的细胞替代治疗带来了新的思路。为探讨体外高效诱导hESs定向分化为胰岛细胞的可行性，优化各阶段细胞培养条件，提高胰岛细胞的分化效率及功能，为糖尿病的细胞替代治疗提供足量的成熟胰岛细胞，我们于2011年3月～2012年3月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 细胞株及试剂 hESCs细胞系来源于山东省干细胞工程技术研究中心自行建立的符合国际标准的IVF来源的人胚胎干细胞系YT1、YT2及YT3［5］。活化素 A、渥曼青霉素、RA、NOGGIN、bFGF、EGF、胰岛素—转铁蛋白—硒复合物(ITS)、尼克酰胺、唾液素-4、BMP4、二脒基苯基吲哚(DAPI)、双硫腙(Dithizone)及荧光二抗购自 SIGMA公司;培养基DMEM/F12及 F12/IMDM购自GIBCO公司;胰岛素、胰高糖素、PDX-1、C肽、Glut-2抗体购自CHEMICON公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将hESCs置于含有10 ng/mL的bFGF及20%KSR(KnockOut serum replacement，knockout血清替代品)的 DMEM/F12中培养，于经丝裂霉素处理的饲养层上扩增，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，3 d换液1次。

1.2.2 体外hESCs定向诱导分化 采用200 U/mL的胶原酶Ⅳ消化hESCs团为较松散的小细胞团，置于基质胶Matrigel包被的培养板中，达到60%融合时分为三阶段诱导hESCs定向分化为胰岛细胞。第一阶段:采用含100 ng/mL活化素 A、1 μM 的渥曼青霉素的DMEM/F12培养4 d，分化形成定型内胚层;第二阶段:hESCs于含有2 μM RA、20 ng/mL bFGF和50 ng/mL NOGGIN的F12/IMDM培养4 d，诱导胰腺细胞定向分化;再予50 ng/mL的EGF培养5 d扩增胰腺祖细胞;第三阶段:采用含1%ITS、10 ng/mL bFGF、10 mM 尼克酰胺、50 ng/mL唾液素-4及10 ng/mL BMP4的DMEM/F12中培养7～9 d，促进成熟胰岛细胞形成。

1.2.3 分化细胞鉴定 倒置显微镜下观察各期细胞形态变化，将诱导4、8、13、20及22 d的细胞分别行PDX-1、胰高糖素、胰岛素、C肽、glut-2共聚焦显微镜免疫荧光鉴定，参照试剂盒说明书操作。一抗4℃孵育过夜，次日二抗37℃孵育30 min，磷酸甘油封片，共聚焦显微镜观察相关抗体荧光表达。

1.2.4 胰岛素及C肽阳性细胞表达测定 分别将诱导1、12、22 d的细胞制成单细胞悬液，4%多聚甲醛溶液固定 15 min，PBS清洗，0.3%Triton X-100处理，0.5%牛血清白蛋白封闭，加一抗孵育，FITC标记荧光二抗，室温下避光孵育30 min，PBS清洗，细胞重悬，流式细胞仪检测胰岛素、C肽阳性细胞表达。

2 结果

2.1 细胞形态学变化 倒置显微镜下观察未分化hESCs呈集落生长，集落分散后悬浮培养生成球形拟胚体(图1A)，拟胚体于Matrigel胶上第1天贴壁生长(图1B)，第4天细胞逐渐伸展爬出细胞集落，呈单层生长，体积开始增大(图1C);第8天细胞开始回缩，体积变小、细胞变圆(图1D);加入EGF后于第13天细胞增殖旺盛(图1E);第20天细胞形成较均一呈规则圆形的胰岛细胞(图1F)。

2.2 hESs分化各阶段细胞荧光表达 诱导分化14 d细胞出现胰高糖素绿色荧光阳性表达(图2A);诱导分化20天出现绿色C肽和红色PDX-1的共表达(图2DEF);诱导分化22 d形成的成熟胰岛细胞出现绿色glut-2(图2B)和绿色胰岛素(图2C)阳性表达。

2.3 将诱导1 d、12 d、22 d细胞进行流式细胞检测胰岛素及C肽阳性细胞表达(图3)，分化22 d胰岛素阳性细胞占17.1%，C肽阳性细胞占3.8%。

图1 hESs向胰岛细胞分化各阶段细胞形态变化

图2 hESs分化各阶段细胞荧光表达

3 讨论

图3 hESs诱导形成的胰岛细胞流式细胞图

胚胎胰腺发育是极其复杂的过程，通过模拟体内胰腺发育过程，近年国内外多个研究团队逐渐探索出多套体外多步骤诱导胚胎干细胞分化为胰岛细胞的方法，经典的五步诱导法分别经过定型内胚层、原始前肠、后前肠、胰腺内胚层及胰腺祖细胞、胰岛细胞等五个阶段，最终形成的成熟胰岛细胞的胰岛素分泌能力低于原生胰岛细胞，功能相当于胎儿时期胰岛，缺乏葡萄糖依赖的胰岛素释放反应，胰岛细胞分化效率仅为7.3%［6］。本研究改良人胚胎干细胞诱导胰岛细胞分化过程，由复杂的五阶段改进为简单高效的三阶段法［7］，先期工作比较了各种诱导分化方法的优劣所在，筛选出有效的胰岛细胞诱导分化方法，经流式细胞分析最终形成的成熟胰岛细胞分化率达到17.1%，共表达C肽和PDX-1是分化胰岛细胞成熟的标志，分化细胞表达胰岛素、胰高糖素、C肽、glut-2提示胰岛细胞功能成熟。

EGF及其受体表达贯穿于整个胚胎胰腺发育过程，EGF受体敲除不能发育生成正常胰腺。EGF是成纤维细胞及上皮细胞等各种细胞增殖所需的重要的细胞因子，联合使用EGF及胃泌素可以恢复STZ诱导破坏的小鼠胰岛β细胞功能［8］。我们在以往研究中发现，EGF可促进胎儿骨髓间充质干细胞、胎儿胰腺干细胞分化为胰岛细胞［9，10］，本研究中发现EGF可促进胰腺祖细胞的扩增。在糖尿病动物模型中发现EGF及EGF受体水平下降，体外实验还发现EGF水平与胰岛素分泌密切相关，EGF及其受体的进一步研究将为糖尿病的细胞替代治疗带来新的思路。

综上所述，本研究构建了高效的三阶段诱导人胚胎干细胞分化为成熟胰岛细胞的方法，为成熟胰岛细胞的体内移植研究提供了实验依据。

［1］《中国糖尿病防治指南2010版》.北京大学医学出版社.北京.2011:1.

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