(1三峡大学分子生物研究所，湖北宜昌 443002;2三峡大学第二临床医学院;3湖北医药学院附属太和医院)

流行病学调查显示，高危型人乳头瘤病毒(HPV)16型感染与宫颈癌的发生有密切关系。其编码的E7蛋白与细胞转化和病毒复制的调控有关，能在宫颈癌组织内及细胞系持续表达，在维持转化组织恶性表型的过程中具有重要作用［1］。因此，以E7基因为靶点的宫颈癌基因治疗已成为研究热点。RNA干扰(RNAi)技术是一种封闭基因表达的有效方法，能通过小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA来介导RNAi作用［2］。2011年7月 ～2012年2月，我们探讨了HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌CaSki细胞生物学活性的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 宫颈癌细胞株CaSki、载体pSilenceU6由本研究所保存。Trizol总RNA纯化试剂和LipofectamineTM2000购自 Invitrogen公司;限制性内切酶、T4连接酶及Taq DNA聚合酶均购自Fermentus公司。兔抗HPV16 E7单抗和β-acting鼠抗人多克隆抗体购自Santa cruz。RPMI 1640细胞培养基购自Sigma公司。EPICSXL-4流式细胞仪为Beckman Coulte公司产品，PCR引物合成及DNA测序由上海生工公司完成。GelLogic-200凝胶图像分析仪为美国Kodak公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及传代 将人宫颈癌CaSki细胞置于含10%小牛血清及1%青霉素(或链霉素)的RPMI 1640细胞培养基中，在5%CO2、37℃、80%湿度的细胞培养箱中传代培养。细胞传代方法:PBS润洗后，胰蛋白酶消化至轻拍细胞脱落;用培养液终止后转至15 mL离心管，800 r/min离心3 min，弃上清液;细胞用培养液重悬后，以1∶3的比例传代。

1.2.2 HPV16 E7特异性siRNA表达载体的构建利用 Ambion网站 siRNA Designer设计靶向HPV16 E7 siRNA靶序列，采用BLAST软件对选择的靶序列进行同源分析，从HPV16 E7 mRNA基因中选择一段19个碱基的E7特异性序列，设计1对63 bp的寡核苷酸，包括内切酶位点及茎环结构。……