史卫红，高胜利，宋祥和，卞勇华，Greg Brothers，李玉华，吴建成

(1.盐城卫生职业技术学院，江苏 盐城 224006;2.苏州大学 附属第一医院，江苏 苏州 215006;3.Department of Medical Biophysics，University of Toronto，Toronto，Ontario，Canada)

白介素-18(IL-18)具有诱导干扰素-γ(IFN-γ)产生、增强自然杀伤细胞(NK)和细胞毒性T细胞(CTL)细胞活性、诱导Thl细胞分化等多种生物学功能，具有强大的抗肿瘤作用［1］。Nagai等［2］将 IL-18转入黑色素瘤B16F10细胞株，发现转染IL-18能抑制移植瘤新生血管形成。近年来，IL-18的抑制肿瘤血管生成作用被一系列研究证实［3-4］。本实验中采用不同剂量的IL-18体内干预人肝癌细胞株HepG2肝癌裸鼠皮下移植瘤生长，流式细胞术检测肿瘤组织及脾组织中 IFN-γ+IL-17+CD4+T、Th17、Th1细胞，探讨IL-18影响肝癌裸鼠皮下移植瘤浸润的T细胞子集变化的机制。

1 材料

人肝癌细胞株HepG2由苏州大学肝病研究中心提供;IL-18，加拿大多伦多大学蛋白质中心实验室主任Greg Brothers教授提供;细胞培养基和胎牛血清(BSA)，杭州四季青公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG抗体、DAB-HCL显色剂、过氧化氢甲醇溶液、羊血清，上海华美公司;淋巴细胞分离液(ficoll分离液)，上海华精生物公司;DMEM、新生小牛血清(FBS)、RMPI 1640培养基，Hyclone公司;佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、离子霉素(ionomycin)，Sigma 公司;布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)，Alexis公司;藻红蛋白(PE)标记抗鼠IL-17、异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗鼠IFN-γ抗体，eBioscience公司。

免疫磁珠阴选试剂盒(Dynabeads Untouched Human CIM T细胞)，Dvnal公司;固定与透膜试剂盒(FIX/PERM)，Caltag公司。

FACS Calibur流式细胞仪，BD公司。

BALB/c裸鼠，雌雄各半，鼠龄5周，体重14.5～17.5 g，购于中国科学院上海动物中心，动物合格证号:SCXK(沪)2007-0005，在苏州大学新校区动物中心SPF级条件下由中心工作人员统一饲养。

2 方法

2.1 肝癌细胞培养及传代

冻存的 HepG2细胞复苏成功后，采用 RPMI 1640完全培养基，制备细胞悬液，37℃、5%CO2饱和湿度温箱中孵育，培养后第1天即可见细胞数的增加，第3～8天为指数增殖期，第10天达到最大密度。……