凌光辉 唐文彬 孙 林 彭佑铭 段绍斌 刘 虹 李 瑛 刘映红 刘伏友

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)最常见的原因之一。肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)是DN发展到ESRD的最主要病理改变,而细胞外基质(extracellular matrix,ECM)沉积是肾间质纤维化的主要组织学改变。高糖导致肾小管上皮细胞ECM沉积增加,转化生长因子β1(transforming growth factor,TGF-β1)在这一过程中起关键作用[1]。TGF-β1/Smads信号通路是经典的TGF-β1细胞内传导途径,受多个因素调控。Smad锚着蛋白(Smad anchor for receptor activation,SARA)是TGF-β1/Smad信号通路的衔接蛋白。SARA可呈递Smad2和Smad3至活化的TGF-βⅠ型受体(TβⅠR),促进其磷酸化,介导TGF-β1信号由其受体活化到核转位的过程。已有研究提示SARA可能参与调节上皮细胞转分化及纤维化,但具体机制不详[2]。本研究旨在探讨SARA在高葡萄糖诱导的HK-2细胞ECM沉积中的作用及机制。

材料与方法

材料与试剂DMEM培养基(美国Gibco公司),胰酶(美国Sigma公司),胎牛血清(中国杭州四季青公司),D-葡萄糖(美国Sigma公司),D-甘露醇(美国Sigma公司),小鼠抗人Ⅰ型胶原(CollagenⅠ,ColⅠ)单克隆抗体(英国Abcam公司),兔抗人纤维连接蛋白(FN)多克隆抗体(美国Sigma公司),山羊抗人SARA多克隆抗体(美国Santa Cruz公司),兔抗人SARA多克隆抗体(美国Santa Cruz公司),兔抗人TGF-β1多克隆抗体(美国Cell signaling公司),小鼠抗人Smad2单克隆抗体(美国Santa Cruz公司),兔抗人Smad3抗体(美国Cell signaling公司),兔抗人p-Smad2多克隆抗体(美国milipore公司),兔抗人p-Smad3多克隆抗体(美国R&D公司),小鼠抗人β肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(美国Santa Cruz公司),辣根过氧化物酶标记抗小鼠二抗、抗兔二抗、抗山羊二抗(中国中杉金桥公司),Trizol(美国Invitrogen公司)、组织细胞蛋白裂解液RIPA(北京鼎国生物公司),逆转录试剂盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)(立陶宛Fermentas公司),PCR引物(由上海生物工程公司合成),SYBR Green ER qPCR SuperMix(美国Invitrogen公司),ECL显影剂,PVDF膜(美国Millipore公司)。……