张元元，李耀康，王 敏，尹红春，王光明

（大理学院临床医学院，云南大理 671000）

过氧化物酶体增殖物激活受体（Peroxisome proliferator activated receptors，PPARs） 是一类由配体激活的核转录因子〔1〕，目前已经确认有三种亚型：PPARα，β，γ（又称为δ或NUC1）。研究认为PPARs参与了脂类、糖类代谢、脂肪细胞的分化，因此，在代谢综合征的治疗方面，PPARs作为潜在的分子治疗靶点而备受关注〔2〕。

Fibrates最早作为降脂、降胆固醇药物在临床中应用〔3〕，随后的研究中发现Fibrates是PPARα的配体〔4〕。除了降脂、降胆固醇作用以外，还具有抗炎、抗氧化的作用〔5〕。有研究显示，在大鼠肺移植模型中，Wy14643（PPARα特异的配体）能够通过上调IL-4，IL-10和TGFβ的表达以降低急性排斥〔6〕，但是在移植物耐受中，其主要机制是抑制免疫反应、抑制成熟型T细胞的形成、记忆型T细胞的形成等。然而，Wy14643是否与之有关，以及另外一种PPARα的配体：Fenofibrate是否也具有相似的作用还不清楚。因此本实验我们利用Fenofibrate或者Wy14643处理的小鼠的脾细胞与处女型小鼠的脾细胞进行混合淋巴细胞反应，以初步探讨Fenofibrate或者Wy14643在诱导移植耐受中的作用，为将来利用Fenofibrate或者Wy14643对移植物进行干预以诱导移植耐受奠定基础。

1 材料和方法

1.1材料C57BL/6J和BALB/c小鼠，六周龄，雄性，购自Charles River（Wilminton，MA，USA），RPMI1640培养基，Fenofibrate、Wy14643和MTT试剂盒购自Sigma公司（St.Louis，MO，USA）和PPARαEMSA试剂盒购自Panomics公司（Fremont，CA，USA）。

1.2方法

1.2.1 动物处理 C57BL/6J小鼠每天经口灌胃1次，每次Fenofibrate，Wy14643（分别为30 mg/mL/kg体重，溶液浓度为3 mg/mL/kg体重），或者CMC（carboxymethyl cellulose）10 mL/kg体重，连续7 d，每组12只小鼠。

1.2.2 混合淋巴细胞反应 在Fenofibrate，Wy14643或者CMC处理7 d后，以正常品系的C57BL/6J小鼠为对照，分别测定BALB/c小鼠脾细胞对药物处理的C57BL/6J小鼠的脾细胞的混合淋巴细胞反应，具体方法如下：无菌条件下取C57BL/6J小鼠的脾脏，以RPMI1640培养基制成脾细胞悬液，台盼蓝染色计算活细胞数，用完全RPMI1640调整细胞浓度至5×105个/mL，作为反应细胞。另取正常BALB/c小鼠脾脏，用相同的方法制成脾细胞悬液，并调节至相同的浓度，25 Gy照射或者不照射刺激细胞，进行单向和双向混合淋巴细胞反应。刺激细胞和反应细胞各取100 μL加入96孔培养板中，每组做9个孔，其中每3个孔为复孔（来源于1只小鼠）。39℃孵育72 h后参照文献〔7〕的方法进行。重复3次（总共9只小鼠）。

1.2.3 EMSA实验 取经Fenofibrate，Wy14643或者CMC处理的C57BL/6J小鼠脾脏，分离脾细胞，然后提出核蛋白，根据Panomics公司的PPARαEMSA试剂盒说明书进行EMSA实验，每组分别取3只动物的脾脏进行实验。

1.2.4 统计学处理 组间用SPSS10.0统计软件处理。首先进行one-way ANOVA分析，然后再进行Scheffle post hoc统计学分析。P＜0.05差异有统计学意义，P＜0.01差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EMSA结果分离C57BL/6J小鼠脾细胞，提出核蛋白进行EMSA实验，见图1。经Fenofibrate或者Wy14643处理，PPARα特异条带明显强于CMC处理组。

2.2 MLR结果在Fenofibrate或者Wy14643处理7 d后，药物处理组的C57BL/6J小鼠脾细胞对处女型BALB/c小鼠脾细胞的单向和双向混合淋巴细胞反应特异性降低（与正常对照组和CMC处理组相比，P＜0.01），见图2。说明Fenofibrate或者Wy14643能够抑制小鼠的脾细胞对抗原的刺激作用。

3 讨论

图1 EMSA结果

图2 混合淋巴细胞反应结果（n＝3）

C57BL/6J小鼠经过Fenofibrate或者Wy14643处理后，EMSA结果显示，在加入过量的无标记的PPARα探针时，仅仅出现较弱的背景，CMC处理的小鼠，其PPARα条带强弱与对照组相似；而Fenofibrate或者Wy14643处理组，有活性的PPARα条带明显增强，说明Fenofibrate或者Wy14643能够增加小鼠脾细胞内的PPARα的活性部分。有研究显示，在人胚胎时期，脾细胞上有PPARα的表达〔8〕，在大鼠脾脏中，PPARα的表达随着年龄的增加而发生改变〔9-10〕；由于人体实验的特殊性，在对小鼠的研究时发现，小鼠经过PPARα的配体：Wy14643、PUFA和Gemfibrozil处理，能够使脾脏中的PPARα在mRNA水平和蛋白水平表达升高〔9，11-13〕，但是PPARα的mRNA水平和蛋白水平表达升高并不能够完全代表表达的PPARα是否具有活性，因此本研究利用EMSA的方法检测经过Fenofibrate或者Wy14643处理的小鼠脾细胞中PPARα的活性情况，结果显示Fenofibrate或者Wy14643处理能够使PPARα的活性升高。

在移植免疫中，单向混合淋巴细胞反应是研究受体免疫细胞是否对供体来源的抗原刺激具有应答效应。在我们的研究中显示，处女型BALB/c小鼠（相当于移植时的供体）的脾细胞经灭活后作为抗原刺激C57BL/6J小鼠（受体）的脾细胞，CMC处理的小鼠，其混合淋巴细胞反应无改变，说明CMC作为药物的溶剂是安全的，而小鼠经过Fenofibrate或者Wy14643处理后，其混合淋巴细胞反应降低；而在双向混合淋巴细胞反应中，Fenofibrate或者Wy14643处理C57BL/6J小鼠的脾细胞作为刺激细胞，仍然能够有效的激活处女型BALB/c小鼠的脾细胞，结合EMSA的实验结果，说明Fenofibrate或者Wy14643可能通过促进PPARα的表达及其增加有活性PPARα的含量，然后通过某种信号通路以抑制淋巴细胞对抗原刺激的反应，Fang等人的研究结果〔9〕显示，另外一种PPARα的配体：perfluorononanoic acid（PFNA）处理BALB/c小鼠，对免疫系统细胞的增殖、细胞凋亡等没有影响；而Qazi等人〔14〕利用PPARα基因敲除小鼠和Cunard等人〔11〕利用Wy14643处理小鼠研究显示，与同龄小鼠相比，其脾脏中淋巴细胞数量、形态等没有区别，但是炎症因子：肿瘤坏死因子（TNF-alpha），白介素6（IL-6）和干扰素-gamma（IFN-gamma）的含量升高，而且激活后的脾细胞其细胞凋亡率升高，该效应是PPARα依赖的，以上结果说明fenofibrate或者Wy14643可以通过激活PPARα以发挥免疫抑制作用，是一类在器官移植中具有免疫抑制效果的免疫抑制剂。

〔1〕Chinetti G，Fruchart JC，Staels B.Peroxisome proliferatoractivated receptors（PPARs）：nuclear receptors at the crossroads between lipid metabolism and inflammation〔J〕.Inflamm Res，2000，49（10）：497-505.

〔2〕Kersten JR，Toller WG，Gross ER，et al.Diabetes abolishes ischemic preconditioning：role of glucose，insulin，and osmolality〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol 2000,278（4）：H1218-1224.

〔3〕Thorp JM，Waring WS.Modification of metabolism and distribution of lipids by ethyl chlorophenoxyisobutyrate〔J〕.Nature，1962（194）：948-949.

〔4〕Issemann I，Green S.Activation of a member of the steroid hormone receptor superfamily by peroxisome proliferators〔J〕.Nature，1990，347（6294）：645-650.

〔5〕Escher P，Wahli W.Peroxisome proliferator-activated receptors：insight into multiple cellular functions〔J〕.Mutat Res，2000，448（2）：121-138.

〔6〕Yanagisawa J，Shiraishi T，Iwasaki A，et al.PPARalpha ligand WY14643 reduced acute rejection after rat lung transplantation with the upregulation of IL-4，IL-10 and TGFbeta mRNA expression〔J〕.J Heart Lung Transplant,2009，28（11）：1172-1179.

〔7〕Hafer-Macko CE，Sheikh KA，Li CY，et al.Immune attack on the Schwann cell surface in acute inflammatory demyelinating polyneuropathy〔J〕.Ann Neurol，1996，39（5）：625-635.

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〔9〕Fang X，Zhang L，Feng Y，et al.Immunotoxic effects of perfluorononanoic acid on BALB/c mice〔J〕.Toxicol Sci，2008，105（2）：312-321.

〔10〕Gelinas DS，McLaurin J.PPAR-alpha expression inversely correlates with inflammatory cytokines IL-1beta and TNF-alpha in aging rats〔J〕.Neurochem Res，2005,30（11）：1369-1375.

〔11〕Cunard R，DiCampli D，Archer DC，et al.WY14，643，a PPAR alpha ligand，has profound effects on immune responses in vivo〔J〕.J Immunol，2002，169（12）：6806-6812.

〔12〕Dasgupta S，Roy A，Jana M，et al.Gemfibrozil ameliorates relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis independent of peroxisome proliferatoractivated receptor-alpha〔J〕.Mol Pharmacol，2007，72（4）：934-946.

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