林秀英,韩振东,尹淑红,崔 尧

(齐齐哈尔医学院附属第三医院皮肤科,黑龙江 齐齐哈尔 161000)

皮肤癌是人类最常见的恶性肿瘤,尤其是发生于暴露部位的鳞状细胞癌,发病率逐年上升,严重影响人类的身体健康。目前皮肤鳞状细胞癌的治疗手段主要是外科切除,人体最暴露部位的手术瘢痕会影响患者的美观需求以及生活质量。近年来肿瘤的化学治疗逐渐引起人们的重视,尤其是联合用药常可提高疗效。第一代维甲酸13-顺维甲酸与干扰素α-2a(IFN α-2a)最早被应用于皮肤鳞状细胞癌患者。第二代维甲酸依曲替酯和干扰素α联合治疗鳞状细胞癌患者取得较好效果[1]。本研究探讨第二代维甲酸阿维 A酸联合干扰素 α-2a对皮肤鳞癌细胞 SCL-1的生长抑制、凋亡诱导作用,为临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂

阿维 A酸购自重庆华邦药业公司。干扰素α-2a(IFNα-2a)购自长春生物制品研究所。细胞培养液、胎牛血清购自美国 Hyclone公司。二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(M TT)为美 国 Sigma公 司产 品。Cell Death Detection ELISAPLUS试剂盒购于德国 Roche公司。Annexin-VFITC检测试剂盒购自深圳晶美公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

SCL-1细胞系生长于含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养液中,置于5%CO2、37℃孵箱中传代培养。

1.2.2 药物处理及分组

阿维 A酸用 DMSO,IFN α用生理盐水配制成储存液-20°C保存,实验时根据需要用培养液稀释。实验设溶媒对照组、不同浓度的单药作用组和联合用药组,其中 IFN α按浓度不同分为100U/mL,500U/mL,1000 U/mL 3个亚组;阿维A酸分为0.1umol/L,1umol/L,10umol/L 3个亚组 ,联合用药组按单药不同浓度进行组合。

1.2.3 细胞增殖抑制试验

将 SCL-1细胞接种在96孔板上,于对数生长期按分组要求加入相应的处理因素 ,每组设6个复孔 ,培养 72 h后 ,加入 MTT20 μL,37℃孵 育 4h,弃上 清 液,每 孔 加 入 100μL DMSO,震荡10min,酶标仪490nm测吸收光度(A)。细胞存活率=(加药组 A值 /对照组 A值)×100%。

1.2.4 Cell Death Detection ELISA检测细胞凋亡

将 SCL-1细胞接种在 96孔板上,根据 M TT实验结果分组如下:溶媒对照组,IFNα组 (100U/mL),阿维 A酸组(I umol/L)及二者合用组 (IFNα 100U/mL+阿维 A酸 I umol/L)。于对数生长期向细胞中分别加入各组药物,培养72 h后按试剂盒说明书检测凋亡。

1.2.5 Annxin-V和 PI结合实验检测早期凋亡

分别用 1umol/L阿维 A酸,100U/mL IFNα,及阿维 A酸联合 IFNα作用于 SCL-1细胞72h后收集细胞 ,Annxin-V和 PI染色后,流式细胞仪检测凋亡细胞。实验步骤按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学处理

相应数据用 SPSS12.0统计包进行方差分析,以P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的阿维 A酸及 IFNα单用或联用72h对 SCL-1细胞的生长抑制作用

三种用药形式均可抑制 SCL-1细胞的生长,与溶媒对照组比较差异有统计学意义 (P＜0.05)。除100U/mL、500U/mL的 IFNα与0.1umol/L的阿维 A酸联合外,其余各联合用药组与单用相比抑制作用明显增强,且抑制作用随浓度的增加而递增。见表1。

表1 阿维 A酸 /干扰素 α对 SCL-1细胞的抑制率(%,±s)

表1 阿维 A酸 /干扰素 α对 SCL-1细胞的抑制率(%,±s)

*P ＜0.05与对照组比较;△P＜0.05与单独应用阿维 A酸或干扰素比较。

2.2 阿维 A酸及 IFNα单用或联用对 SCL-1细胞的凋亡诱导作用

方差分析 Cell Death Detection ELISA检测结果,各组凋亡吸光度总体均数不等(F=80.35,P＜0.01)。进一步两两比较,100U/mL的 IFN-α,lumol/L的阿维 A酸及二者联合应用均能诱导 SCL-1细胞凋亡,与溶媒对照组比较差异有统计学意义 (P＜0.05)。联合用药组对 SCL-1细胞凋亡的诱导作用显著高于单用应用 IFNα或阿维 A酸组,差异有统计学意义 (P ＜ 0.05)。见图1。

图1 阿维 A酸、干扰素α作用 SCL-1细胞72h后的凋亡诱导情况

2.3 AnnexinV和 PI双标记法检测凋亡率

方差分析 Annxin-V和 PI结合实验结果,各组早期凋亡率总体均数不等 (F= 66.03,P＜0.01)。进一步两两比较,100 U/mL的 IFNα,l umol/L的阿维 A酸及二者联合应用均能诱导 SCL-1细胞早期凋亡,与溶媒对照组比较差异有统计学意义 (P＜0.05)。联合用药组对 SCL-1细胞凋亡的诱导作用显著高于单用应用 IFN α或阿维 A酸组,差异有统计学意义 (P ＜ 0.05)。见图2、图3。

图2 Annexin v和 PI双标记法检测阿维 A酸、干扰素α诱导 SCL-1细胞凋亡

图3 阿维 A酸、干扰素α作用 SCL-1细胞72h后的早期凋亡率

3 讨论

诱导肿瘤细胞凋亡的方法,除常规的化疗、放疗与激素治疗,细胞因子的应用也越来越广泛。体外实验证明,采用联合用药的诱导凋亡疗法,对肿瘤的治疗可能是最有效可行的。因此,寻求有效的诱导肿瘤凋亡疗法,成为目前肿瘤治疗领域的一个热点。维甲酸类化合物已证实对人类多种恶性肿瘤具有诱导分化、抑制增殖、诱导凋亡等作用[2]。由于存在对维甲酸的耐受、敏感性低的肿瘤类型,以及维甲酸所带来的副作用,限制了它的临床应用。为了解决这一问题,人们探索维甲酸与其它药物联合使用以提高肿瘤对维甲酸治疗的敏感性,已经取得了一定的进展。已有研究证实阿维 A酸能够抑制皮肤鳞癌细胞 SCL-1生长并诱导凋亡[3]。干扰素是细胞因子中的一个家族,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学功能[4]。IFNα能诱导皮肤鳞癌细胞凋亡[5,6],并抑制其增生。本研究应用细胞增殖抑制实验检测不同浓度阿维A酸、IFNα单独或联合应用对 SCL-1细胞的增殖抑制情况。该方法简便、快速,所需细胞数较少,便于进行药物敏感实验,目前已广泛用于临床前抗癌药物筛选研究。结果发现,阿维 A酸、IFNα单独或联合应用72h均可抑制 SCL-1细胞增殖。联合用药与单独用药比较均具有显著的差异,并且在一定范围内有剂量依赖性,说明联合应用具有协同抗癌作用。根据我们的 M TT实验结果,选择阿维 A酸1uM联合IFN100U/mL组 ,阿维 A酸1uM组,IFN1000U/mL组及溶媒对照组作为后续实验分组。Cell Death Detection ELISA及Annxin-V和 PI结合实验检测结果显示,联合应用阿维 A酸与 IFN对 SCL-1细胞的凋亡诱导作用明显高于单独应用阿维 A酸或 IFN,说明二者可协同诱导皮肤鳞癌细胞凋亡。综上所述,本研究证实维 A酸与 IFNα联合应用,可增效减毒,抑制 SCL-1细胞增殖并诱导其凋亡。阿维 A酸 /IFNα联合应用为皮肤鳞癌的化疗提供可选药物组合,从分子角度深化了阿维 A酸与 IFN协同抗肿瘤的作用机制。从而为皮肤鳞癌的治疗提供了新的思路。

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