刘 爽,魏 巍,张 辉,侯 杰,张淑红,罗 兰,范晓艳

(佳木斯大学,黑龙江 佳木斯 154007)

肿瘤的侵袭性与转移性是肿瘤恶性生物学行为,也是肿瘤难以彻底治愈的主要原因,随着原发性恶性肿瘤治疗疗效的提高,生存期的延长,转移性肿瘤在临床上出现的频率也在增加。因此国内外研究人员对于肿瘤细胞转移机制的研究一直是研究热点。细胞外基质磷酸糖蛋白(Matrix Endocellular Phosphoglycoprot Ein,MEPE)是 2000年 Rowe PS等人最早在肿瘤源性骨软化症(tumor induced osteomalacia,TIO)的肿瘤中分离得到的,其定位于人的第4号染色体(4q21.1),认为是一种肿瘤细胞分泌的磷酸化蛋白因子[1]。通常作为细胞基质蛋白与细胞的运动、附着及迁移能力密切相关,本实验探讨 MEPE蛋白对细胞附着能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞、菌株及载体

细胞株与质粒 MEPE cDNA质粒与 CHK1 cDNA质粒,均由美国 EMORY大学王亚教授馈赠。M RC5细胞株购自上海中国科学院细胞研究所。质粒 pLEGFP-N1为 BD Biosciences Clontech公司产品,大肠杆菌 E.coli DH5α由本室保存。

1.2 主要试剂

PCR产物纯化采用 BIO101公司提供的 Geneclean II试剂盒(Cat#1001-400);质粒提取采用 Qiagen公司 QIAprep质粒提取试剂盒;Chk1抗体购自 Santa Cruz生物技术公司;ECL显色系统购自 Amersham Biosciences公司;限制性内切酶及 T4DN A连接酶购自 Takara生物公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠及羊抗兔抗体购自中山生物技术公司。

1.3 仪器

PCR仪、UV-160紫外分析仪、半干转膜系统、凝胶成像系统使用均在佳木斯大学生命科学实验中心完成。

1.4 PCR扩增、表达质粒的构建及序列测定

由质粒上扩增出 MEPE cDN A全长,所用扩增引物为:上游引物:5′-CATATGAAGC TGAATGAAGAT-3′下游引物:3′-GGATCCTTACATT TGGGGGAGATG-3′PCR扩增的目的基因经 Nde I与 BamH I双酶切后,克隆到经过同样……