黄璠 蔡俊

在我国，饲用酶制剂的开发与利用始于20世纪90年代[1]。多年来，人们发现蛋白酶对动物尤其是幼龄动物有着独特的作用，目前饲料工业中应用的蛋白酶多为酸性蛋白酶，而不同pH值的蛋白酶对饲料作用的影响正成为饲料行业的一个研究热点，已有相关报道，中性蛋白酶作为饲料添加剂有很好的效果[2－4]。但中性蛋白酶的产量低、成本高等因素限制了其大规模应用[5]。本研究以枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶的发酵条件为研究对象，通过单因素试验和正交试验优化了产酶的发酵条件，取得了很好的效果，为进一步提高该菌产中性蛋白酶的能力奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），本实验室保藏。

1.1.2 培养基

斜面培养基：蛋白胨 10 g/l、牛肉膏 5 g/l、氯化钠5 g/l、琼脂 20 g/l、水 1 L，pH 值 7.2～7.4。

种子培养基：液体斜面培养基。

发酵培养基：蛋白胨10 g/l、牛肉膏5 g/l、蔗糖10 g/l、磷酸氢二钠 4 g/l、硫酸镁 0.2 g/l、水 1 L，pH 值 7.2。

1.2 试验方法

1.2.1 初始发酵条件

取活化好的斜面菌株，接种一环到一级种子培养基（50/250 ml），37℃、160 r/min培养14 h后，以3%(V/V)的接种量接入发酵培养基（50/250 ml），37℃、160 r/min培养48 h。

1.2.2 蛋白酶活力测定[6]

按国家标准(GB/T23527—2009)，采用 Folin－酚法测定中性蛋白酶活力。

1.2.3 发酵条件优化

1.2.3.1 发酵条件的单因素试验

采用单因素试验，分别考察装液量、转速、培养基初始pH值、发酵周期、接种量和发酵温度对产酶的影响。装液量(250 ml三角瓶中)分别为 30、50、70、90 ml；转速分别取160、180、200和220 r/min；培养基初始pH值分别取 6.2、6.7、7.2、7.7和 8.2；发酵周期分别取24、36、48、60、72 和 84 h；接种量分别取 1%、2%、3%、4%、5%；发酵温度分别取33、35、37、39和 41 ℃。

1.2.3.2 发酵条件的正交试验

在上述单因素试验的基础上，选取部分影响较大的因素（装液量、初始pH值、发酵周期），进一步缩小范围进行3因素3水平正交试验，正交试验因子与水平设计见表1。……