潘梦音，赵建龙，袁 帅，李世朋，贾岩岩，曹鹏涛，周 洁，冯凯祥

KiSS-1及VEGF在肝细胞癌组织中的表达及临床意义

潘梦音，赵建龙，袁 帅，李世朋，贾岩岩，曹鹏涛，周 洁，冯凯祥

目的探讨KiSS-1蛋白和血管内皮生长因子（VEGF）在肝细胞癌中的表达及临床意义。方法 采用免疫组化法检测33例HCC组织，25例癌旁组织和20例正常肝组织中KiSS-1蛋白和VEGF蛋白的表达情况。结果HCC组织中的KiSS-1蛋白和VEGF的阳性表达率分别为27.27%（9／33）、81.82%（27／33）；在癌旁组织及正常肝组织中则分别为的72.00%（18／25）、52.00%（9／25）和85.00%（17／20）、45.00%（9／20），差异均具有统计学意义（P＜0.05）；肝细胞癌中KiSS-1蛋白和VEGF的表达均与肿瘤分化程度、临床分期及淋巴结转移有密切联系，二者在HCC中的表达呈负相关（r＝－0.770，P＜0.05）。结论KiSS-1蛋白在肝细胞癌中的表达明显下调，VEGF蛋白在肝细胞癌中的表达增多，二者表达呈现负相关性，可能参与促进了肿瘤的发生、侵袭和转移。

肝细胞癌；KiSS-1蛋白；VEGF；免疫组化；侵袭；转移

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原发性肝癌90%以上［1］，目前其治疗手段仍以外科手术为主，但效果欠佳。因此，加强对HCC发展转移分子机制的研究尤为重要。KiSS-1基因是在人类黑色素细胞株中发现、分离并克隆出的一个新的肿瘤转移抑制基因［2］，能显著抑制肿瘤细胞浸润侵袭。HCC的生长、浸润和转移均依赖于血管的病理性增生，而血管内皮生长因子VEGF在此过程中扮演着重要角色。本文采用免疫组化法对KiSS-1蛋白和VEGF在HCC中的的表达情况进行观察，并探讨KiSS-1蛋白和VEGF与HCC扩散、侵袭和预后的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集解放军150中心医院2006年6月～2011年8月接受肝细胞癌手术治疗患者术后存档的33例HCC患者病理蜡块标本，所有患者术前均未行放化疗，病例临床资料完整。另取癌旁组织25例和正常组织20例作为实验对照。

1.2 主要试剂与设备KiSS-1兔抗人抗体（稀释浓度1∶100），VEGF兔抗人抗体（稀释浓度1∶150）、SP －0023免疫组化试剂盒（美国ZYMED公司产品）均购自北京博奥森生物技术有限公司；DAB显色试剂盒（AR－0612）购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.3 方法采用免疫组织化学法SABC常规石蜡包埋组织切片，脱腊水化，DDW、PBS冲洗，抗原修复维持15 m in后冷却至室温，PBS冲洗2 m in×3次，加去离子水室温下孵育10 min，PBS冲洗2 min ×3次，每张切片滴加抗山羊血清室温下孵育。滴加一抗4℃冰箱过夜，PBS冲洗2 min×3次。滴加生物素标记二抗室温孵育30 m in，PBS冲洗5 m in×3次，DAB显色，显微镜下控制反应。蒸馏水漂洗，苏木精复染，盐酸酒精分化，脱水，中性树胶封片。

1.4 染色结果判定选用试剂盒中的阳性片作为阳性对照，PBS取代一抗作为阴性对照。KiSS-1蛋白，VEGF可以表达于细胞质和（或）细胞膜，染色呈棕黄色视为阳性。每张切片随机选择5个高倍视野，每个高倍镜视野（×200）计数100个细胞，采用半定量积分法依据染色强度和阳性细胞百分率判断染色结果［3］。

1.5 统计学方法应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。样本率的比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KiSS-1蛋白的表达KiSS-1蛋白在HCC组织中呈弱阳性表达，表达率为27.27%（9／33），较之于癌旁组织的72.00%（18／25）和正常肝组织的85.00%（17／20），呈现明显的降低和缺失，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 VEGF的表达在HCC中VEGF高表达，细胞胞膜和胞质中可见大量棕黄色染色，阳性表达率为81.82%（27／33），明显高于癌旁组织和正常组织中VEGF阳性表达率52.00%（13／25）和45.00% （9／20），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 KiSS-1蛋白、VEGF的表达与HCC临床病理参数的关系KiSS-1蛋白、VEGF的表达均与HCC组织分型、临床分期及淋巴结转移有关。肝细胞癌组织中，低未分化、Ⅲ～Ⅳ期和淋巴结转移阳性者KiSS-1蛋白的表达明显低于高中分化、I～Ⅱ期和无淋巴结转移者（P＜0.05）；而VEGF在低未分化、Ⅲ～Ⅳ期和淋巴结转移阳性的HCC组织中的表达显著高于其在高中分化、I～Ⅱ期和无淋巴结转移HCC组织中的表达（P＜0.05），见表1。

2.4 KiSS-1蛋白与VEGF的表达关系33例HCC组织中，KiSS-1蛋白表达阳性，VEGF表达阴性的组织有6例；KiSS-1阴性，VEGF阳性的组织有24例。采用Spearman相关检验计算相关系数，表明两种蛋白在肝细胞癌中的表达存在负相关性（r＝－0.770，P＜0.05）。二者在HCC中表达呈负相关趋势，见表2。

表1 肝细胞癌中KiSS-1蛋白和VEGF表达与临床病理学参数的关系

表2 KiSS-1蛋白和VEGF在肝细胞癌中表达的相互关系

3 讨论

肿瘤转移是导致肝癌患者高死亡率的主要原因之一，因此能否控制肿瘤转移直接影响到恶性肿瘤患者的治疗及预后。相关实验研究表明［4］，肿瘤转移是一个复杂的过程，往往涉及多个癌基因和抑癌基因的改变，癌基因的活化与抑癌基因抑制功能之间的失衡是导致其发生的基础。KiSS-1是在人类黑色素细胞株中发现的一种新肿瘤转移抑制基因，定位于1号染色体长臂区lq32～q41区［5］包含4个外显子，其编码的由145个氨基酸组成的亲水性蛋白［6］能够抑制肿瘤细胞浸润侵袭，限制肿瘤细胞迁移能力［7］。实验研究表明乳腺癌、胰腺癌等癌组织中KiSS-1的表达明显低于癌旁组织［8－9］。本研究结果显示肝细胞癌组织中KiSS-1蛋白表达与癌旁组织和正常肝脏组织相比明显减少，以上差异均具有统计学意义（P＜0.05）；随着肝细胞癌肿瘤分化程度的升高KiSS-1蛋白阳性表达率升高（P＜0.05）；Ⅲ～Ⅳ期肝癌组织中KiSS-1蛋白的表达水平分别比I～Ⅱ期低（P＜0.05）；有淋巴结转移肝癌中的阳性率明显低于无淋巴结转移者（P＜0.05）。提示KiSS-1蛋白的缺失与HCC的发生、临床侵袭及淋巴结转移有关，是一个癌抑制基因。

为了保持自身无限制侵袭性生长，肿瘤组织必须依赖持续广泛的新生血管形成［10］。肝细胞癌是多血管恶性肿瘤，其生长、浸润和转移均依赖于血管。VEGF是近年来备受人们关注并被公认为人体内最强的一种血管生成促进因子，具有多种受体。Yoshiji H等［11］曾用VEGFR-1和VEGFR-2的单克隆抗体R-1mAb和R-2mAb对VEGFR-1和VEGFR-2分别进行中和，发现两者都能显著地通过抑制肿瘤新生血管生成的方式达到抑制一些相关肿瘤生长；两种抗体联合则几乎可以达到完全阻断肿瘤发展和血管生成的目的。本研究中发现VEGF在肝癌组织中的表达要远高于癌旁组织和正常组织（P＜0.05），另外在肝细胞癌组织中的表达与组织分型、临床分期和有无淋巴结有关（P＜0.05），表明VEGF在肝癌的发生发展和血管生成的过程中发挥着重要作用。

本研究在对KiSS-1蛋白和VEGF阳性表达率数据的对比分析中发现癌组织中二者的表达呈显著负相关（r＝－0.770，P＜0.05），提示KiSS-1和VEGF与肝细胞肿瘤的侵袭、转移有关，同时检测KiSS-1、VEGF蛋白的表达有助于综合评估HCC的生物学行为，并为肝癌机制及可行治疗措施的探索研究提供了实验基础及理论依据。

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Exp ression and Clinical Significance of KiSS-1 and VEGF in Hepatocellu lar Carcinom a

PAN Meng-yin，ZHAO Jian-long，YUAN Shuan，et al
（Medical College，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

ObjectiveTo observe the expression of metastasis suppressor gene KiSS-1 and vascular endothelial growth factor（VEGF）in hepatocellular carcinoma（HCC），and explore its clinical significance.MethodsThe expressions of KiSS-1 protein and VEGF were detected by immunohistochem istry in 33 cases of HCC tissue，25 cases of tumor-surrounding tissue and 20 cases of normal liver tissue. Resu lts The positive rate of KiSS-1 protein and VEGF in HCC tissue were 27.27%（9／33），81.82%（27／33）respectively；and in tumor-surrounding tissue and normal liver tissue were 72.00%（18／25），52.00%（9／25）and 85.00%（17／20），45.00%（9／20）（P＜0.05）respectively.The expressions of KiSS-1 protein and VEGF were both related with clinical stages，differentiation degree and lymph node metastasis.There was a negative correlation between the expressions of KiSS-1 protein and VEGF in HCC.（r＝－0.770，P＜0.05）.ConclusionThe expression of KiSS-1 protein is visibly decreased in HCC tissue，and the expression of VEGF is increased，one＇s positive rate was negatively correlated with the other one，which may be involved in tumor genesis，invasion，and metastasis.

hepatocellular carcinoma；KiSS-1 protein；VEGF；invasion；metastasis

R735.7

A

1672－688X（2012）04－0244－03

1.河南省教育厅自然科学研究项目（2007310002）

2.河南科技大学大学生研究训练计划项目（2012182）

2012－08－24

河南科技大学医学院，河南洛阳471003

潘梦音（1992－），女，河南平顶山人，临床医学2010级在读本科生。

赵建龙，男，副教授，E－mail：yxyzjl20861＠163.com