张方舟，王 益，颜文君，周海鹏，周闯华，吕 坪

·法医学·

上下法与传统急性毒性法测定薄荷油LD50的试验研究

张方舟，王 益，颜文君，周海鹏，周闯华，吕 坪

目的本实验以薄荷油为目标物，评价了上下法与传统法小鼠急性毒性试验相比的优缺点。方法采用薄荷油对小鼠灌胃，分别进行上下法急性毒性试验与传统法急性毒性试验，观察中毒现象，计算LD50及其95%可信区间。结果上下法薄荷油急性毒性LD50为2 000 mg／kg（798.5～2 150 mg／kg），传统法LD50为1 589.68 mg／kg（1 405.37～1 798.08 mg／kg）。结论两种方法所得LD50值接近，毒性分级相同。上下法作为急性毒性替代法对于药物安全性评价领域有较好的应用价值和发展前景。

上下法；传统急性毒性法；半数致死量（LD50）；薄荷油

急性毒性实验应用范围很广，例如食品、药品、化妆品、农药、工业毒物等毒理学安全性评价。诸多研究表明，受多种内部和外部因素影响，LD50（半数致死剂量）往往仅是一个统计数值。因此，随着全球对动物福利的关注，各种节省动物使用量的急性毒性替代试验受到越来越多的关注。上下法（up-anddown procedure，UDP）是经济合作与发展组织（OECD）于2001年发布的急性经口毒性试验方法之一，该方法不仅大大减少了动物的使用量，并且可以最大似然法计算LD50值和95%可信区间［1－2］。该方法于2008年被我国接纳为化学品检验国家标准［3］，已有研究表明，UDP法测定农药等化学品急性经口染毒的LD50与Horn’s法比较结果相近，毒性分级相似［1，4－6］。但对于药物有效成分的毒性研究，目前传统急性毒性试验及LD50值的精确测定仍是我国药品注册法规的组成部分，UDP法在此方面的适用性研究鲜见报道。尤其当前，我国对传统中药材或天然药物成分的安全性评价，缺失较为严重，相关药物的急性毒性亟待研究。以薄荷油为例，具有多种药理功能［7－8］，口服可用于消化道疾病，民间也常用于吸入剂治疗恶心、呕吐、紧张性头疼等［9］。一般认为其无毒，但有报道表明，大量口服可导致肝脏毒性［10］，或引发间质性肾炎和急性肾衰相关的病症［9］，并可能导致死亡［10］。

因此，本次试验研究拟以薄荷油作为受试物，通过比较UDP法与经典法（改良寇氏法）LD50的测定结果，进一步了解UDP法替代传统方法对天然有效成分毒性研究的可靠性，为药物安全性评价领域中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 受试物薄荷油（北京弘发中药材饮片有限公司，产品标准号：Q／DCL004－2008），用芝麻香油配制成适当乳液备用。

1.2 实验动物KM小鼠，体质量18～20 g，雌雄各半，由河南科技大学实验动物中心提供。饲养于河南科技大学实验动物中心动物房。

1.3 实验方法实验动物随机分组，雌雄各半，整个试验过程中，动物自由摄水，每次给药前一晚禁食不禁水。给药前称量体质量，观察14 d，记录所需动物数量和实验耗时。

1.3.1 传统实验法 预实验：按一次给最大剂量法，给药0.4 m L／10 g体质量；取小白鼠20只，雌雄各半，随机分为5组，分别灌胃给予5 mg／kg、50 mg／kg、500 mg／kg和2 000 mg／kg 4个固定剂量，另一组灌胃给水作为阴性对照组。正式实验：取50只小白鼠，雌雄各半，随机分为5组，依据预实验结果，给予适当浓度受试样品灌胃。

1.3.2 UDP法 限度试验：限度剂量2 000 mg／kg（特殊情况限度剂量选择5 000 mg／kg），用5只动物进行预实验，按照剂量水平的限度实验标准，估计LD50。正式实验：固定默认Sigma（级数因子）0.5，相应剂量组距3.2，剂量从以下序列中选择：175 mg／kg、550 mg／kg、2 000mg／kg。第1只动物给药剂量低于LD50估计值，如果该动物存活，第2只动物给予高一剂量；如果第1只动物死亡或濒死状态，第2只动物给予低一剂量。在此程序中每次给药1只动物，间隔至少48 h，并认真观察动物。当满足停止实验标准之一时，以图1为例：①在上限剂量时，连续3只动物存活；②任意连续6只实验动物中有5只发生存活／死亡的转换；③在出现第1次存活／死亡转换后，至少又试验了4只动物，自此时起，对每只实验动物进行似然比计算，一旦似然比超过临界值，停止试验。对于LD50和斜率变化很大的化合物，试验出现逆转后再进行4～6只实验动物即可满足停止规则。在一些情况下，对于剂量—反应曲线斜率较小的化学物质，可能需要更多的动物（最高试验动物总数为15）。具体终止试验条件，亦可根据AOT425StatPgm软件的提示进行，停止给药后，同时根据终止时所用动物的状态计算LD50估计值和可信区间。

1.4 数据处理传统急性毒性实验法，依据每组动物死亡数，采用适当的统计方法（Bliss法或改良寇氏法）计算受试物的LD50及其95%可信区间。UDP法实验，将每次染毒剂量及动物的结局输入AOT425StatPgm程序［2］，计算LD50和95%可信区间。

2 结果

2.1 给药后一般状况UDP法试验组与传统法试验组小鼠，灌胃薄荷油后，大部分动物立即出现四处不停走动、攀爬、呼吸运动急促，打动等兴奋症状；30 m in后逐渐安静，并出现步履蹒跚，行动缓慢，左右摇摆，气息微弱。大多数小鼠在灌胃后24 h内出现异常反应；部分有异常反应的小鼠可逐渐恢复正常。对死亡小鼠解剖，肉眼检查可见小鼠肝脏有不同程度的颜色变深、呈点状、表面粗糙；胃及肠道呈气球状，小鼠腹部明显膨大。

2.2 UDP法和传统法薄荷油灌胃动物死亡情况和LD50计算方法UDP法，选择限度剂量为：2 000 mg／kg；假定LD50：175 mg／kg；级数因子设定为（Sigma）：0.5；使用推荐剂量序列（mg／kg）：2 000，550，175，55，17.5，5.5，1.75。而传统急性毒性试验，根据预试验结果以及文献LD50值，等比级数0.8，设定给药剂量，假定一半动物组少于半数死亡，另一半动物组多于半数死亡；但实际根据动物的死亡情况，并未形成良好的正态分布，因此选择改良寇氏法作为统计方法。具体的动物死亡情况、计算方法和LD50计算结果，如表1所示。

表1 UDP法和传统法急性毒性试验的动物结局和LD50值

将UDP法动物结局，输入AOT425 StatPam程序，显示LD50为2 000 mg／kg（798.5～2 150 mg／kg）；传统法经改良寇氏法计算，LD50为1 589.68 mg／kg （1 405.37～1 798.08 mg／kg）。在动物消耗方面，UDP法共消耗16只，传统法共消耗70只。在时间消耗方面，UDP法共消耗24 d，传统法共消耗14 d。实验结果表明，两种方法所计算的LD50值较为接近，毒性分级相同。对一个未知受试物进行经典的传统急性毒性试验，消耗动物量是较大的，一般预实验10 ～20只，正式试验40～60只，本次试验耗费动物70只；使用UDP法，限量试验耗费动物4只，主试验耗费动物12只，减少动物消耗77.14%。亦可见，UDP法耗时长于传统法近1倍，这也表明，在使用UDP法时，对动物质量的保障供应有一定要求。

3 讨论

任何一种药物或制剂在临床试用前必须进行动物毒性实验，急性毒性实验是新药安全性评价的第一道环节。但越来越多的新药研发机构和管理当局意识到传统的急性毒性实验存在局限性：由于动物生理状态、周围环境等因素的影响，同一种药物的LD50在不同的实验结果中，往往很难得到一个稳定的数值［11］。以薄荷油的急性毒性LD50值为例，陈光亮等研究表明，薄荷油灌胃给药最大耐受量＞4 000 mg／kg，腹腔注射LD50为（1 149.9±78.5）mg／kg［12］。而刘红杰等则报道，口服小鼠薄荷油的LD50为3.0 m L／kg［13］，以薄荷油相对密度（0.888～0.908）换算，相当于2 694 mg／kg。与本次试验结果皆有较大差别。由此亦可见，LD50值的计算受到各种因素影响较多。而人和动物对药物的敏感性差别很大，很难期望使用动物的急性毒性试验的结果来推测对人体的毒性情况［14］。由于LD50测定造成的不必要的动物和资源的浪费，受到伦理学界和科学界越来越广泛的批评，而采用消耗动物较少的急性毒性替代试验将是药物急性毒性试验的必然趋势。

本次试验结果也表明，采用UDP法所获得的LD50值与传统法较为接近，使用的动物数远少于传统法所消耗的动物数。给药后观察到，口服薄荷油的中毒小鼠表现出明显的神经毒性作用，这与传统法以及已有报道较为一致［12］。由此可见，UDP法是传统急性毒性试验的一种优良替代方法，能够以最少的实验动物和受试样品量，与传统方法一样得到受试物的LD50值及相应的可信区间；对每只给药后的动物进行48 h的密切观察，并对未死亡的动物持续观察14 d，能够提供全面的受试动物毒性表现的资料［15］。这符合药物安全性评价动物急性毒性的实验要求。因此，UDP法作为急性毒性替代实验法在新药研发和药品申报领域具有一定的发展空间［14，16］。该方法的不足之处在于：由于试验要求分阶段进行，因此耗时较长，同时又要有相同动物质量供应的保障，无法提供量效关系数据，只适于评价染毒后48 h内出现毒性症状并死亡的受试品的急性毒性［6，15］

［1］ Rispin A，Farrar D，Margosches E，et al.Alternativemethods for themedian lethal dose（LD50）test：the Up-and-Down procedure for acute oral toxicity［J］.ILAR Journal，2002，43 （4）：233－243.

［2］OECD.OECD guidelines for the testing of chem icals guideline 425 acute oral toxicity-Up-and-Down procedure［S］.Paris：OECD，2001：1－26.

［3］ 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB／T 21826 －2008化学品急性经口毒性试验方法上下增减计量法（UDP）［S］.北京：中国标准出版社，2008：1－24.

［4］ 连勇，徐培渝，孙强.上—下法替代实验与Horn’s法测定LD50的试验研究［J］.现代预防医学，2008，35（18）：3591 －3593.

［5］ 谭剑斌，赵敏，杨杏芬，等.3种替代方法在急性经口毒性实验中应用研究［J］.中国职业医学，2011，38（增刊）：1 －4.

［6］ 张林媛，孙金秀.上下增减剂量法与Horn’s法测定LD50的研究［J］.卫生毒理学杂志，2003，17（4）：234－236.

［7］ 陈光亮，余玉宝，李冬梅.薄荷油及其有效成分药理作用的研究概况［J］.中国中医药信息杂志，2000，7（2）：33 －34.

［8］ 花盈，狄留庆.薄荷油的基础研究及其应用开发［J］.世界临床药物，2006，27（8）：505－507，512.

［9］ 涟漪.薄荷油（Pepperm int oil）［J］.国外医药：植物药分册，2005，20（1）：42－43.

［10］刘红杰，金若敏.薄荷油研究进展［J］.山东中医药大学学报，2006，30（6）：502－505.

［11］朱心强，黄幸纾，叶方友，等.固定剂量法与传统LD50试验的比较［J］.卫生毒理学杂志，1992，6（4）：287，281.

［12］陈光亮，姚道云，汪远金，等.薄荷油药理作用和急性毒性的研究［J］.中药药理与临床，2001，17（1）：10－12.

［13］刘红杰，金若敏，张文斌，等.薄荷油致小鼠肝毒性时－量关系及其机理研究［J］.时珍国医国药，2007，18（12）：2954－2956.

［14］郭家彬，彭双清.动物实验替代方法与21世纪毒性测试发展策略［J］.中国比较医学杂志，2011，21（10、11）：157－161，156.

［15］李佳，金晶，黄芝瑛.上下法在急性毒性试验中的应用进展［J］.中国比较医学杂志，2008，18（6）：70－72.

［16］胡启之.OECD新发布急性经口毒性试验方法简介［J］.毒理学杂志，2005，19（4）：323－325.

Experim ental Study on Measurement of Pepperm int Oil LD50 With Up-and-Down Procedure and Traditional Acute Toxicity Testing

ZHANG Fang-zhou，WANG Yi，YAN Wen-jun，et al
（College of Forensic Medicine，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）

ObjectiveThe peppermint oilwas used as a target object in this experiment.To evaluate the advantage and disadvantage of the up-and-down procedure and the traditional acute toxicity testing.Methods Mice were orally administered with peppermint oil to respectively conduct the up-and-down procedure acute toxicity test and traditional method acute toxicity test，observing the poisoning phenomenon and calculating the median lethal dose（LD50）and 95%confidence intervals.ResultsThe LD50values of peppermint oil from the two methods were 2 000 mg／kg（798.5～2 150 mg／kg）with the up-and-down procedure and 1 589.68 mg／kg（1 405.37～1 798.08 mg／kg）with the traditionalmethod respectively.ConclusionThe LD50values that get from the two methods are similar，and the toxicity grading is equal.This shows that the up-and-down procedure，as an alternativemethod of acute toxicity，has better application value and development prospects in the field of drug safety evaluation.

up-and-down procedure；the traditional acute toxicity testing；median lethal dose（LD50）；pepperm int oil

R965.3

A

1672－688X（2012）04－0268－03

2011年河南科技大学SRTP项目（2011179）

2012－10－07

河南科技大学法医学院，河南洛阳471003

张方舟（1989－），男，河南三门峡人，法医2009级在校本科生。

吕坪，女，博士，讲师，E-mail：lping2008＠163.com