(辽宁医学院，辽宁锦州121001)

研究发现，雌激素在子宫内膜癌的发生发展中起关键作用，雌激素—雌激素受体(ER)有两种亚型ERα(-A、-B、-C)、ERβ。近年来，关于肿瘤组织中抑癌基因启动子区CpG岛的异常甲基化成为研究的一个新热点。抑癌基因的沉默、DNA的错配修饰都与其相关基因甲基化改变密切相关［1～4］。2011年5～9月，我们观察了DNA甲基化抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(ADC)处理前后子宫内膜癌细胞中ERα各亚型的甲基化状态及其蛋白表达的变化，探讨ERα各亚型CPG岛甲基化状态与子宫内膜癌的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 人子宫内膜癌细胞系Ishikawa(ER高表达)由北京大学人民医院惠赠，HEC-1B细胞系(ER低表达)购自中国生命科学院上海细胞库，均经传代培养至对数生长期。离心柱型DNA抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司，Zymo Research EZ DNA Methylation Kit购自 Promage公司，ADC购自Sigma公司，ER多单隆抗体购自Santa Cruz公司。参考文献设计［5］各引物序列，由Sangon公司合成。

1.2 方法

1.2.1 ADC对子宫内膜癌细胞最佳抑制浓度的确定 采用MTT法。取对数生长期的Ishikawa和HEC-1B消化传代后，以3×103/孔接种96孔板，待细胞贴壁后，观察组分别加入终质量浓度为1、2、4、8μg/mL的ADC培养72 h，对照组不加ADC;再加入0.5%MTT 20μL培养4 h，弃上清;每孔加入150 μL的DMSO，低速震荡10 min，用酶标仪测定每孔490 nm波长处光密度(OD)值。计算细胞增殖抑制率，确定ADC最佳抑制浓度。细胞增殖抑制率=(1－观察组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.2 ADC处理前后ER各亚型启动子区甲基化状态检测 采用甲基化特异性PCR(MSP)法。取ADC最佳抑制浓度处理前后的Ishikawa和Hec-1B，按DNA提取试剂盒(离心柱法)说明抽提细胞DNA;采用 Zymo Research EZDNA Methylation Kit对提取的DNA进行甲基化处理(纯化和修饰)，以修饰后的DNA为模板进行PCR扩增，从而检测ER各亚型启动子区甲基化状态。……