毕秀欣

[摘要] 通过对酶联免疫吸附实验检测HIV抗体的检测前、检测中和检测后各相关影响因素的分析，探讨各因素对结果的影响，以便寻找解决的方法和加强质控管理，从而保证检测结果的准确性和精确性。

[关键词] 酶联免疫吸附实验；HIV抗体；影响因素

[中图分类号] R446.61[文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）02-0076-02

The impact factors of enzyme-linked immunosorbent assay in detection of HIV antibodies

BI Xiuxin

International Travel Health Care Center of Dandong in Liaoning Province, Dandong 118000, China

[Abstract] By analysis of all relevant factors in pre-test, during test and post-test of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in detection of HIV antibodies, to explore the various impact factors on the results, in order to find a solution and strengthen the quality control management, to ensure accuracy and precision of the test results.

[Key words] ELISA; HIV antibody; Impact factors

酶联免疫吸附实验因其操作简单、灵敏度高、特异性好、价格低廉等特点成为HIV抗体初筛实验的常用方法。优质的试剂、良好的仪器、正确的操作和高素质的技术人员是保证检测结果准确可靠的必要条件。由于ELISA法检测结果受很多因素影响，其中任何一项因素都可造成HIV抗体结果假阴性和假阳性结果的发生。因此必须加强HIV抗体初筛实验室的全面质量控制，保证其结果的准确可靠。笔者从事多年的HIV抗体检测工作，现将影响因素分析如下。

1 检测前

1.1 试剂

1.1.1 试剂的选择优质的HIV抗体试剂是结果质量的基础。试剂要从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性和经济性做出全面的评价并选择好的试剂，根据实验室要求选择灵敏度高（精密度高，CV值＜15%）、特异性好的试剂。试剂的选择很关键，通过厂家了解试剂包被物的组成，如原料来源（基因组成或合成多肽）、片段组成（按比例组成或化合组成）、片段长短等来判断抗原、抗体包被的完整性和特异性。根据试剂批号检定报告了解其质量水平和试剂的优劣，还可以室间质评报告中对试剂的评价结果来客观评价、选择适合实验室的试剂。要选择和订购长效批号的试剂，避免试剂批号改变而重新建立质量控制体系[1]。

1.1.2 试剂的储存试剂应储存在2～8℃冰箱中，力求温度恒定，并防止阳光照射。试剂盒中有3个主要的试剂，即免疫吸附剂、酶结合物和底物。酶结合物具有生物活性，保存不当，极易失活；底物容易被氧化，产生颜色。因此，必须加强试剂的储存管理，防止试剂失活和氧化。

1.2 标本

血清是最常用的标本。酶联免疫吸附实验中标本的质量也是影响结果的关键因素之一，标本的干扰物质容易引起假阳性或假阴性的结果。干扰分为外源性和内源性。外源性干扰：细菌污染、溶血、凝固不全、反复冻融和标本相互污染等；标本放置4℃冰箱冷藏一般不超过5 d，如果保存过久，其中的蛋白质可能发生聚合，可使本底加深；冻结的标本要融化后充分混匀，为防止蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分轻轻混匀，避免产生气泡；浑浊或有沉淀的样本应先离心澄清后再检测；防止反复冻融，引起效价降低。内源性干扰：一般包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异性免疫球蛋白、异嗜性抗体及某些自身抗体等，避免内源性干扰因素主要通过选择合适的试剂。①标本溶血时释放大量具有过氧化物酶活性的物质，增加了非特异显色，干扰测定结果[2]；②标本被细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；③血清标本应充分离心，否则可因凝固不全、纤维蛋白原非特异吸附于微孔内而造成假阳性结果。

1.3 仪器

酶联免疫吸附实验中会用到移液器、水浴箱或恒温箱、洗板机、酶标仪等。移液器是一种比较精密的工具，要求比较高，必须定期对加样器进行维护和校准[3]。每次加样需更换吸嘴，以免交叉污染。水浴箱温度要准确恒定；洗板机要定期维护，检测残液量。

2 检测中

2.1 加样

在HIV抗体检测中加样3次，即加标本、加酶结合物、加底物。加样时要将所加物加入板孔底部，避免加在孔壁外部，产生气泡，吸取样品速度要均匀，保证加样量准确；加完样品要在微量振荡器上震荡1min以保证混合均匀。

2.2 温育的时间和温度

要力求保证温育的时间和温度，酶联免疫吸附实验属于固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相的表面发生，样品中的抗体并不是都有均等的机会与固相的抗原结合，而是最贴近孔壁的一层溶液中的直接与抗原接触，是一个逐渐平衡的过程，因此需要经过扩散才能达到反应的终点，要保证足够的温育时间，才能使产物生成达到顶峰，有的实验室为加快速度，提高反应温度，但盲目提高温度会影响酶的活性。

2.3 温育的方式

常采用温箱法、微波辐射法和水浴法。其中水浴法能较好地解决因受热不均衡所致周围孔与中央孔结果的吸光度差异（即边缘效应），可将ELISA板置于水浴箱中。无论温育还是水浴，反应板不可叠放，以保证各板的温度尽快达到平衡，反应板要贴近水面，温育时要防止挥发或水珠溅入影响结果。

2.4 洗涤

洗涤虽然不是一个反应步骤，但也影响实验的成败。洗涤的目的是分离游离和结合的酶标记物，通过洗涤来实现清除残留在板孔中的没能与固相抗原结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质，洗液的配制要按照要求，太浓会解离包被在固相的抗原，过低削弱洗涤效果。可以说洗涤是HIV抗体ELISA法检测的最主要的技术，操作者要严格按照要求洗涤，不能马虎，否则前功尽弃。洗涤包括仪器自动洗涤和手工洗涤。仪器洗涤要注意定期检测残余量，检测吸液针和注液针是否堵塞，及时更换洗液和废液，防止时间过长引起细菌污染和废液倒流；手工洗涤包括有浸泡式和流水冲洗式两种。手工洗板要注意孔间的交叉污染和洗涤间隔时间。

2.5 显色与比色

显色是ELISA法中最后一步温育反应，反应时间和温度仍是影响显色的因素。TMB受光照影响不大，但OPD底物受光照会自行变色，因此，显色反应应避光进行。显色的温度和时间要力求准确充分，并在规定的时间内比色，防止时间过长会褪色。比色时应尽量选用双波长进行比色，这样可以排除干扰，比色前要用吸水纸拭干板底附着的液体，防止孔内产生气泡，对测定结果产生干扰。

3 质量控制

3.1 开展室内质量控制（IQC）

室内质量控制程序，每次或每天之间不可能没有误差，决定允许的误差范围以临床上不造成误诊和漏诊为准，选择一个弱阳性的室内质量控制品，其S/CO值应该为2～4之间。利用L-J质量控制图，认真分析每次的失控的原因，要解决失控，必须分析造成失控是随机的还是系统的很重要，随机误差表现离散度增大，而系统误差逐渐产生，如漂移或者倾向性，如果是系统误差，再对系统误差进行分析。实验室每月、每一季度要对室内质量控制结果进行分析总结，对当月的均值、变异系数等进行比对分析，及时发现问题，及时采取纠正措施来提高检测结果的可靠性。

3.2 外部质量控制

积极参加室间质评能力验证活动，通过室间质评和能力验证，利用实验室间比对来确定实验室检测或校准能力的活动，判断和监控实验室内部质量控制方法，有效消除偏差，对分析结果起到校准和复核作用。有效地实施能力验证，在实验室质量控制中起着非常重要的作用。利用实验室间的比对和能力验证来不断提升实验室的能力。

3.3 加强人员培训

人员是实验室最宝贵的资源，一个实验室水平的高低很大程度上取决于人员的素质，尤其是关键的技术岗位人员，因此，有针对性地加强人员培训，对艾滋病初筛实验室是非常重要的[4]。

[参考文献]

[1]于振喜，李连洁. 用ELISA法检测HIV抗体时如何避免“花板”[J]. 中国医药导报，2006，3（23）：56.

[2]陈云钰. ELISA法检测HIV抗体需注意的影响因素[J]. 中国卫生检验杂志，2011，21（6）：1564-1565.

[3]全国艾滋病检测技术规范（2009年修订版）[S]. 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心，2009：1-5.

[4]张斌. 实验室管理、认可与运作[M]. 北京：中国标准出版社，2005：162-164.

（收稿日期：2011-11-18）