邢超　陈慧　杨军军　王郑　郭文坚

[摘要] 目的 探讨患者外周血细胞膜上CD55和CD59缺陷对阵发性睡眠性血红蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）的诊断价值。 方法 采用流式细胞术对CD55-PE及CD59-FITC标记的患者外周血中性粒细胞和红细胞进行检测。对2009年1月～2012年3月来我院就诊的13例PNH患者、13例再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）、21例骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者、12例缺铁性贫血（irondeficient anemia，IDA）患者与同期80例健康体检者进行回顾性分析。 结果 PNH患者中性粒细胞及红细胞膜表面CD55、CD59较AA、MDS、IDA及健康体检者均明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 利用流式细胞术检测贫血患者外周血红细胞及中性粒细胞膜上CD55和CD59缺陷，是临床鉴别诊断PNH与AA、IDA、MDS可靠而敏感的指标。

[关键词] 流式细胞术；CD55；CD59；阵发性睡眠性血红蛋白尿

[中图分类号] R446.11[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701（2012）29-0079-02

阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）是获得性细胞膜缺陷引起的一种溶血性贫血，与再障关系密切，可相互转变。发病时可表现为贫血、血红蛋白尿、感染及血栓形成[1]。近年来，流式技术日渐成熟，利用流式细胞术检测患者外周血中红细胞与粒细胞表面CD55和CD59是目前绝大多数实验室诊断PNH的首选方法，较传统检测方法敏感性高且方便。本文采用流式细胞术（flow cytometre，FCM）对于59例贫血患者的外周血细胞CD55、CD59缺失率进行检测，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

对2009年1月～2012年3月来本院及一附医就诊的贫血患者共59例进行回顾性分析，其中PNH患者（A组）13例，男9例，女4例，平均年龄（48.3±11.8）岁；MDS患者（B组）21例，男15例，女6例，平均年龄（67.4±12.8）岁；AA患者（C组）13例，男11例，女2例，平均年龄（30.2±22.4）岁；IDA患者（D组）12例，男5例，女7例，平均年龄（44.5±20.2）岁；同期正常体检或无贫血相关疾病患者（E组）80例，男42例，女38例，平均年龄（45.2±10.5）岁。

1.2 PNH诊断标准

（1）临床表现符合PNH；（2）实验室检查：酸化血清溶血试验（Ham试验）、糖水试验、蛇毒因子溶血试验、尿潜血或尿含铁血黄素试验中凡符合下述任何一种情况，即可诊断。①二项以上阳性；②一项阳性，但须具备以下条件：（a）两次以上阳性，或一次阳性，但操作正规，有阴性对照，（b）有溶血证据，（c）能排除其他溶血，如G6PD缺乏所致溶血、自身免疫性溶血性贫血等[2]。

1.3 结果判读

以健康体检者红细胞和粒细胞CD55、CD59表达设定阴性阈值，CD55、CD59百分率减少大于10%认定为PNH阳性，减少5%～10%为可疑阳性。

1.4 试验方法

所有病例均采用流式细胞术进行红细胞和粒细胞膜上CD55和CD59检测。流式细胞仪为BD公司FACS CantoⅡ，所有试剂均购自BD公司。

1.4.1 中性粒细胞荧光抗体标记取患者及同期健康对照者肝素抗凝血各100μL，加入1×BD红细胞溶血素1 mL，15 min后溶血，弃上清，加入3 mL PBS缓冲液混匀后500 g离心5 min，弃上清，加入CD59-FITC、CD55-PE及同型对照各20 μL，避光反应30 min，加入PBS 400μL，待上机检测。

1.4.2 红细胞荧光抗体标记取患者及同期健康对照者肝素抗凝血各20 μL，加入2 mL PBS缓冲液混匀，各取20 μL加入BD专用流式管中，分别加入CD59-FITC、CD55-PE及同型对照各20 μL，避光反应30 min，加入PBS 400 μL，待上机检测。

1.4.3 流式细胞仪校正取标准荧光微球各数滴（BD公司提供），加1 mL PBS稀释、混匀，上机调整电压及补偿。

1.5 统计学方法

采用SPSS13.0软件分析，组间计量资料的比较采用方差检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

PNH患者中性粒细胞CD55阳性率较MDS、AA、IDA及正常对照组均明显减少，P < 0.05，差异均有统计学意义；PNH患者中性粒细胞CD59阳性率较MDS、AA、IDA及正常对照组均明显减少，差异均有统计学意义（P < 0.05）。

PNH患者红细胞CD55阳性率较MDS、AA、IDA及正常对照组相比均明显减少，P < 0.05，差别均有统计学意义；PNH患者血红细胞CD59阳性率较MDS、AA、IDA及正常对照组相比均明显减少，差异均有统计学意义（P < 0.05）。

MDS组患者中性粒细胞及红细胞表面CD55和CD59阳性率分别与AA组、IDA组及Normal组比较，无明显变化，差异均无统计学意义（P均>0.05）。见表1，图1～4。

表1PNH、MDS、AA、IDA组与Normal组血细胞CD55、CD59阳性率（%）

注：P1：A与B、C、D和E比较；P2：B与C比较；P3：B与D比较；P4：B与E比较

3 讨论

PNH是一种特殊的获得性造血干细胞克隆性疾病。近年来的研究证实，位于X染色体上的磷脂酰肌醇聚糖-A（PIG-A）基因发生体细胞水平的突变[3]，α1-6-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶功能受到影响，进而糖基化磷脂酰肌醇（GPI）合成障碍，导致血液细胞膜表面多种锚定蛋白缺失，如衰变加速因子（CD55）和反应性溶血膜抑制物（CD59），这些可以抵抗补体作用的补体调节蛋白的缺失是导致PNH发病的关键所在。发生PIG-A基因突变的造血干细胞再分化和分裂过程中具有增殖优势而形成的具有体细胞突变和GPI锚定蛋白缺失为特征的细胞群，简称PNH克隆[4]。PNH患者必然存在PNH克隆，但PNH克隆也存在于其他骨髓增殖异常疾病。再生障碍性贫血（AA）、骨髓增生异常综合征（MDS）等骨髓增生异常疾病患者体内也可检测到PNH克隆的存在，因此这也是导致PNH与AA具有某些相似症状的原因[5，6]。

本文通过对59例贫血患者外周血细胞CD55、CD59阳性表达率检测，表明PNH患者CD55、CD59阳性表达率明显降低，尤其是在中性粒细胞膜上，其CD55阳性率仅约为52.5%，CD59阳性率约为56.4%，但在红细胞中其阳性率分别为67.3%和71.8%。提示患者中外周血中性粒细胞CD59缺陷细胞比例高于红细胞。有学者认为粒细胞寿命短，更新快，测定值主要反映自身造血产出细胞的情况，受输血影响小，其表面CD59的表达较为稳定，因而外周血中性粒细胞CD59的表达更能反映骨髓中PNH克隆的情况。而在AA患者中可见其也有CD55、CD59的缺失，有个别患者阳性率<95%，但不超过90%，提示疾病可能有进行性变化，有PNH克隆细胞的存在，但仍以正常细胞为主。MDS患者的外周血细胞中CD55、CD59有缺失，其中可见有5例患者缺失率<95%，1例<90%，提示患者存在PNH克隆细胞，今后有概率发展为PNH或PNH-MDS综合征，有待进一步观察。

综上，流式细胞术检测患者外周血细胞CD55、CD59可作为PNH诊断指标，但在AA、IDA、MDS患者细胞上均有不同程度的改变，与曹文俊[7]报道结果一致。因而对于AA、MDS有着一定的监测意义，故建议把流式细胞术检测红细胞与粒细胞膜的CD55、CD59的表达作为PNH的早期诊断检测项目，并作为PNH、AA、MDS患者长期监测指标之一，对于其临床诊断与预后都有着极其重要的应用价值。

[参考文献]

[1]王永才. 血液骨髓细胞检验学[M]. 大连：大连出版社，1995：2-10.

[2]张志南.血液病诊断及疗效标准[M]. 第2版. 北京：科学出版社，1998：88-96.

[3]俞秋兴，单卫民，朱永新，等. AA、MDS、PNH患者CD55、CD59检测的临床价值[J]. 临床检验杂志，2002：175-176.

[4]谭齐贤. 临床血液学和血液检验[M]. 北京：人民卫生出版社，2003：149-150.

[5]Azenishi Y，Ueda E，Machii T，et al. CD59-deficiant blood cel1s and PIG-A gene abnormalities in Japanese patients with aplastic anaemia[J].Br J Haematol，1999，104：523-529.

[6]Dunn DE，Tanawattanacharoen P，Boccun IP，et al. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria cells in patients with bone marrow failure syndromes[J].Ann Intern Med，1999，131：401-408.

[7]曹文俊. CD55/CD59缺陷检测及其在阵发性睡眠性血红蛋白尿诊断中的意义[J]. 诊断学理论与实践，2004，3（6）：416-419.

（收稿日期：2012-06-25）