闫长青，赵玉沛，刘三光，戚 诚，张建生，王文斌

(1河北医科大学第二医院，石家庄050011;2中国医学科学院北京协和医院)

胰腺癌细胞是血管生成因子重要来源，胰腺癌细胞同时产生多种血管生成因子，血管生成因子表达水平可能与胰腺癌细胞增殖与侵袭密切相关［1，2］，血管生成因子之间特别是VEGF与bFGF的表达可能存在相互调节［3，4］。2011年3～6月，我们分别用VEGFsiRNA及bFGFsiRNA转染胰腺癌细胞株sw1990、PCT-3及Panc-1，观察VEGFsiRNA和bFGFsiRNA对胰腺癌 sw1990、Panc-1及 PCT-3细胞bFGF表达水平的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 人胰腺癌细胞株sw1990、Panc-1、PCT-3由北京协和医院基本外科实验室保存。VEGFsiRNA、bFGFsiRNA、control siRNA(Fluorescein Conjugate)及siRNA Transfection Medium购自美国SANTA CRUZ公司(sc-36868);siRNA Transfection Reagent Lipofectamine2000及总RNA提取试剂购自美国Invertrogen公司;bFGF ELISA检测试剂盒购自美国R＆D公司。

1.2 实验方法

1.2.1 siRNA转染胰腺癌细胞株 先参照文献［2］方法进行预试验观察转染效率。将细胞接种于6孔板，每孔2×105个细胞，加入2 mL含10%胎牛血清的无抗生素RPMI1640培养基，37℃、5%CO2培养至细胞60%～80%融合。将VEGFsiRNA、bFGFsiRNA复合物和Lipofectamine2000分别溶解与100 μL siRNA Transfection Medium。然后轻轻混合，在室温下孵育30 min。取转染复合物0.2 mL加0.8 mL的siRNATransfection Medium，混匀加入洗涤后的sw1990、Panc-1、PCT-3细胞。37℃、CO2培养箱孵育6 h;10 000 r/min离心。

1.2.2 bFGF mRNA检测 采用RT-PCR法检测sw1990、Panc-1、PCT-3细胞中的bFGF mRNA。先参照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA。逆转录合成cDNA后行PCR扩增:引物由上海生工生物技术有限责任公司合成。引物序列:bFGF:5'-AGCGGCTGTACTGCAAAAAC-3'，5'-CCCAGGTCCTGTTTTGGAT-3'。β-actin:5'-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3'，5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。紫外灯下照相并分析。相对表达量(A)=A目的基因/Aβ-actin。

1.2.3 bFGF蛋白检测 采用ELISA法检测上清液中的bFGF蛋白。操作按试剂盒说明书进行。结果以450 nm处OD值表示。所有检测样本重复两次，以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据标本样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。……